引物的應(yīng)用常識引物的原理引物是短的寡核苷酸片段，充當(dāng) DNA復(fù)制的起點。因為幾乎所有 DNA聚合酶都不能從頭合成，所以它們需要一個3'羥基作為DNA合成的起始點。這個3'羥基由相配的引物提供。在體內(nèi)，由于DNA聚合酶的忠實性，不能從頭合成 DNA，因此只能由RNA聚合酶（稱為引物酶）生成，采用RNA引物來延伸，在延伸過程中， RNA引物降解并由DNA取代。在體外PCR反應(yīng)中所用到的DNA引物，是根據(jù)不同的要求及模板序列設(shè)計，然后用化學(xué)法人工合成的，與模板形成雙鏈后在DNA聚合酶的作用下就可以繼續(xù)鏈的延伸；對于大多數(shù) PCR反應(yīng)，決定整個反應(yīng)成功與否的最重要因素是引物的序列和質(zhì)量。不同實驗要求的引物選擇在開始設(shè)計引物之前，必須弄清以下幾點：（1）明確PCR的目的（例如克隆、 SNP檢測、定量檢測等）（2）確定樣品材料（基因組DNA、RNA、微小RNA）（3）確定PCR的類型（普通的、定量PCR、RT-PCR、長片段PCR），在查找序列的時候還需要考慮可能存在的問題（如假基因等）引物設(shè)計的重要因素有一些不同的軟件工具可用于引物設(shè)計和引物分析。引物設(shè)計的軟件如 oligo6.22，Premier5.0，PrimerExpress3。引物分析常用Primer5，Oligo6.22，Primer-Blast。目前生工生物給客戶提供的引物設(shè)計服務(wù)引物用的是在線軟件 Primer3plus，*引物長度和專一性常見的引物長度為18-30個堿基。短的引物（＜15堿基）能非常高效地結(jié)合，但是它們的專一性不夠。較長的引物能提高專一性，然而退火效率低，從而導(dǎo)致 PCR產(chǎn)量低下。同時應(yīng)避免編碼單一序列和重復(fù)序列的引物。*平衡GC含量，避免GC-和AT-富集區(qū)域引物的GC含量應(yīng)介于40%?60%之間。應(yīng)避免聚-（dC）-或聚（dG）-區(qū)域，因為它們會降低退火反應(yīng)的專一性。聚 -（dA）-和聚（dT）-也應(yīng)避免，因為這樣會形成不穩(wěn)定的引物-模板復(fù)合物，從而降低擴(kuò)增效率。* 3'-序列3'端為G-或C-核苷酸較好，因為能增加結(jié)合強(qiáng)度。同時它將提高 PCR效率，因為引物-模板符合物的開放將達(dá)到最小。但是，超過 3個G/C堿基將會具有負(fù)面效果，因為會降低反應(yīng)的專一性。*避免互補(bǔ)的引物序列引物設(shè)計應(yīng)避免引物自身序列的互補(bǔ)性超過 3個堿基。因為這容易使引物形成自身發(fā)夾結(jié)構(gòu)。5’ACGGATACCATGCCTATG3’5f入CGGATACCATGCCTATG3r上下游引物之間的互補(bǔ)配對也應(yīng)避免，尤其在作為擴(kuò)增起始點和關(guān)鍵區(qū)域的 3'端。因為這將導(dǎo)致強(qiáng)引物二聚體形成，后者將與所需要的PCR反應(yīng)競爭資源，導(dǎo)致PCR效率降低，在極端情況下，甚至導(dǎo)致完全無特異性目的產(chǎn)物生成。5’ACTTGCATGTC7AGTCAC3'3*CAGTGAGT7ACATGACTG51?退火溫度是基于引物的解鏈溫度(Tm)……計算方法。最常用的解鏈溫度計算公式如下三種： “2+4法則，亦稱華萊士法則，對于14個堿基以下引物有效，Tm=2(A+T)+4°C?(G+C)另外，還有GC法則，適用于長于13個堿基的序列，這兩種方法都相對不準(zhǔn)確。(G+CJfrJ)Tm=M.9°C+■!i* (A+i+■G+C)鹽調(diào)整”法相對準(zhǔn)確一些，考慮到了反應(yīng)緩沖液中的中的 Na+離子濃度(50mMNa+,pH7.0)。C+G muV-43* ——‘“‘：“'—”1&卜1嘩.百也丁但是不管根據(jù)哪種方法計算岀的解鏈溫度， 都可用于估算最佳退火溫度，也都僅作為實驗參考溫度。引物使用的常見問題:Q-1:OD值的概念？A-1:OD是opticaldelnsity(光密度)的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度， OD=log(1/trans)，其中trans為檢測物的透光值。 吸光度(absorbanee)，是指光線通過溶液或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)度與該光線通過溶液或物質(zhì)后的透射光強(qiáng)度比值的對數(shù)，影響它的因素有溶劑、濃度、溫度等等，吸光系數(shù)與入射光的波長以及被光通過的物質(zhì)有關(guān)。 只要光的波長被固定下來，

同一種物質(zhì)，吸光系數(shù)就不變。引物是以 OD260值來計量的。在1ml的1cm光程標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿中，260nm波長下吸光度為1的引物溶液定義為 1OD260。雖然對于每種特定的寡核苷酸來說，其堿基的組成不盡相同，但 1OD260引物的重量約為33ug，每個堿基的平均分子量約為330Da。因此合成的引物摩爾數(shù)可按以下公式近似計算： 摩爾數(shù)（mol）=[OD值*33]/[堿基數(shù)*330]=0.1*[OD值/堿基數(shù)]。Q-2:需要合成多少OD的引物？A-2:一般來說，20BP2OD引物可以做400-500次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，以及2000?2500次的測序反應(yīng)。因此，2OD的DNA量足以進(jìn)行一般的實驗工作。如果是做基因拼接或退火后做連接，1OD就足夠了，無論是PAGE純化，還是HPLC純化，增大每次的純化量會大大降低制品的純度。為了保證制品質(zhì)量，我們一般把每次的純化量控制在 2OD左右。Q-3:如何測定引物的OD值？A-3:DNA的量與260nm處的吸光度值（OD值）成正比，因此使用紫外分光光度計定量是最科學(xué)的，測定時溶液的光密度最好稀釋到 0.2-1.0之間。進(jìn)行OD值測定時，分光光度計上顯示的數(shù)值為每毫升溶液中的OD值。例如：您拿到一管引物 DNA干粉，用1ml水溶解成母液。取該母液50卩L稀釋成1ml，在1ml標(biāo)準(zhǔn)比色杯中測定其吸光度為 0.25，說明該50卩L中含有0.25OD的DNA，也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。Q-4:最長可以合成多長的引物？80堿基，如果A-4:引物越長，出現(xiàn)問題的概率就越大。除非需要，建議合成片段長度不要超過您的實驗需要，我們可以接受 11080堿基，如果Q-5:為什么引物的OD260/OD280小于1.5?Q-5:引物應(yīng)該全是DNA，但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質(zhì)污染？引物化學(xué)合成，哪里有機(jī)會污染到蛋白質(zhì)？需要指岀的是 OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中 C/T的含量比較高所致。下表是一個20堿基同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。Q-6:否根據(jù)引物電泳后EB染色后條帶的亮度對合成的引物進(jìn)行定量 ?A-6:不能，EB是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的 DNA分子為單鏈，只有通過自身回折形成局部發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)或鏈間形成部分雙螺旋結(jié)構(gòu)， 才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據(jù) EB染色帶的亮度來對合成的DNA進(jìn)行定量。建議用紫外分光光度計的方法如上面題 Q-3中的方法.Q-7:引物定量不準(zhǔn)的可能原因有：我們偶爾收到用戶投訴定量不準(zhǔn)的報告，岀現(xiàn)這種情況的可能性有：(1)生產(chǎn)人員定量錯誤。這種可能性有， 但是不大，因為我們的生產(chǎn)人員都是經(jīng)過嚴(yán)格的培訓(xùn)，程序化規(guī)范操作和換算。公司內(nèi)部的考核機(jī)制也使得分裝人員沒有必要故意少給用戶 0D數(shù)。(2)弓|物抽干或收樣過程中，弓I物干粉可能意外丟失。這種情況很少見。(3)系統(tǒng)誤差，我們認(rèn)為10%左右為允許誤差。使用過程中，引物工作濃度范圍很寬，定量上的少許偏差不影響實驗。(4)用戶沒有能夠正確理解引物 0D數(shù)的含義，沒有能夠正確使用分光光度計，特別是使用微量測定；或者用戶沒有將 0D讀數(shù)，正確地轉(zhuǎn)換成母液中的 0D數(shù)。這種情況比較常見。(5)用戶收到引物干粉時，打開引物管蓋前沒有離心或其他誤操作導(dǎo)致引物干粉部分丟失。Q-8:用3%的瓊瓊脂糖凝膠電泳合成的引物，為什么有很多條帶？Q-8:引物是單鏈DNA，容易形成復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進(jìn)行瓊脂糖電泳時，容易岀現(xiàn)多條泳帶(更不能用瓊脂糖電泳來進(jìn)行定量了)。 OligoDNA的電泳一定要使用變性PAGE電泳，瓊脂糖電泳對于小單鏈的DNA引物的區(qū)分度不夠。而且，用熒光TLC板在紫外燈下觀察，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用銀染方式染色。Q-9:引物溶解后發(fā)現(xiàn)有少許沉淀，會影響實驗結(jié)果嗎 ？A-9:DNA制品使用C18柱進(jìn)行吸附，偶而會有微量的樹脂溢岀而進(jìn)入制品。樹脂不影響任何反應(yīng)結(jié)果，請稍許離心后取上清使用即可。Q-10:瓊脂糖電泳時，長度完全一樣的 OligoDNA為什么泳帶不在同一位置 ？A-10:A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同； DNA的立體結(jié)構(gòu)不同，電泳速度不同;OligoDNA越短時越容易發(fā)生，長鏈 OligoDNA之間差別較小Q-11:合成引物的5'和3'末端有磷酸基團(tuán)嗎？Q-11:5'和3'端均為-OH基。如需要加磷酸基團(tuán)，訂貨時請?zhí)貏e注明，此時需收取磷酸化的費(fèi)用。Q-12:端的PCR產(chǎn)物難以克隆，為什么？A-12:由于一般的PCR用引物的5末端都沒有P，因此，擴(kuò)增后的 PCR產(chǎn)物的5末端也沒有P。當(dāng)克隆于去磷酸化的末端平滑載體時，無法克隆進(jìn)去；而當(dāng)克隆于非去磷酸化的末端平滑載體時，背景會極高。此時請對 PCR產(chǎn)物的5端進(jìn)行磷酸(P)化處理。Q-13:如何溶解并保存引物？Q-13:客戶收到的引物干粉， 經(jīng)過一系列處理和純化步驟， 旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。 干燥的引物在常溫至少可以穩(wěn)定存放二周以上不會降解，由于干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前最好在3000-4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，防止開蓋時引物散失。我們的的合成報告單給岀了每 OD引物稀釋為100卩mol/L(即100pmol/ul)濃度的加水量，您可以根據(jù)您的實驗需要加入適量的滅菌的雙蒸水或10mMTE緩沖液(PH7.5-8.0)，室溫放置幾分鐘，上下顛倒混勻后分裝成小份放-