flpfr位點特異性重組法表達人凝血因子

人類凝血因子（hf）是一種由肝臟合成的維生素k依賴性單鏈糖蛋白。它在凝血過程中起著非常重要的作用。這是凝血形成的第一個重要因素之一。hFⅦ主要通過與暴露的組織因子(Tissuefactor,TF)結(jié)合,形成穩(wěn)定的TF-FⅦ復合物而啟動外源凝血途徑,同時對內(nèi)源性凝血途徑的啟動具有特殊的調(diào)節(jié)作用。正常情況下,人血漿中的FⅦ主要以酶原形式存在,且含量非常低,約為200~400ng/ml,屬于微量蛋白,而活性形式的FⅦ含量僅占1%。血漿來源的FⅦ難以規(guī)模化制備,基因重組技術的發(fā)展為重組人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ)的規(guī)?；苽涮峁┝丝赡堋Ｄ壳?唯一的藥用重組人活性凝血因子Ⅶ諾其誖(NovoSeven誖)由丹麥諾和諾德(NovoNordisk)公司研發(fā)并生產(chǎn),1999年經(jīng)FDA批準上市,在全世界50多個國家注冊使用,安全方便,但價格較昂貴,限制了其在發(fā)展中國家的應用,因此rFⅦ的大規(guī)模制備和研究具有重要意義。目前,不同實驗室對于各物種rFⅦ的表達主要采用隨機整合的方式,由于基因組絕大多數(shù)的隨機整合位點位于非轉(zhuǎn)錄活性區(qū),所得細胞株的表達水平距離規(guī)模化生產(chǎn)的要求相差甚遠。鑒于隨機整合的“位置效應”對細胞篩選所造成的負面作用,本研究采用了Flp-In表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)是新近發(fā)展起來的一種表達系統(tǒng),已有成功高效表達外源蛋白的報道,主要包括:帶有FRT(Flprecombinationtarget)序列的表達載體,能夠表達重組酶Flp的輔助質(zhì)粒和基因組轉(zhuǎn)錄活性區(qū)整合有單一FRT位點的細胞系。該系統(tǒng)可將目的基因穩(wěn)定整合進細胞的基因組FRT位點處,從而實現(xiàn)外源基因在細胞基因組轉(zhuǎn)錄活性區(qū)穩(wěn)定持續(xù)的表達。本文采用了Flp/FRT位點特異性重組系統(tǒng),將攜帶有編碼hFⅦ基因的質(zhì)粒定點整合在Flp-In-CHO細胞基因組的轉(zhuǎn)錄活性區(qū),通過潮霉素B的壓力篩選,獲得了穩(wěn)定表達rhFⅦ蛋白的CHO細胞株。1.材料和方法1.1血液化學品質(zhì)粒pT-FⅦ和感受態(tài)E.coliDH5α均由軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所血液生物制品研究室制備并保存;Flp-In-CHO細胞、載體pcDNA5/FRT/TO和輔助質(zhì)粒pOG44均購自Invitrogen公司。1.2檢測試劑和檢測方法小鼠抗hFⅦ單克隆抗體由軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所血液生物制品研究室制備并保存;TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶均購自NEB公司;dNTPs、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和RNAM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Promega公司;潮霉素B和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒均購自Invitrogen公司;HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司;硝酸纖維素膜(NC,φ77mm,孔徑0.45μm)購自九鼎高科過濾設備(北京)有限公司;陽性對照NovoSeven誖購自丹麥NovoNordisk公司;SuperECL超敏發(fā)光液購自北京普力萊基因技術有限責任公司;hFⅦ促凝活性檢測試劑盒(凝血酶原時間測定,PT法)購自四川協(xié)和生物技術有限公司;DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、胎牛血清和小牛血清均購自GIBCO公司。1.3pcr擴增f基因用EcoRⅠ和EcoRⅤ分別雙酶切表達載體pcDNA5/FRT/TO和質(zhì)粒pT-FⅦ,回收載體片段和FⅦ基因片段,純化后用T4DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α。參照GenBank中登錄的hFⅦ基因序列(NM_019616),應用PrimerPremier5.0軟件設計引物,PCR擴增FⅦ基因,序列如下:上游(F1):5′-CGCGGATCCACCATGGTCTCCCAGGCC-3′,下游(R1):5′-CGGGATATCCTAGGGAAATGGGGCTG-3′。利用F1/R1對轉(zhuǎn)化子進行PCR鑒定。反應體積為20μl:50pmol/μl引物各1μl,10×反應緩沖液2μl,dNTPs1μl,MgCl22μl,TaqDNA聚合酶1μl。反應條件:94℃變性5min,94℃60s,56℃45s,72℃90s,共30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后進行觀察和照相。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ對PCR擴增呈陽性的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,將酶切鑒定為陽性的克隆送北京三博遠志基因技術有限公司測序。1.4flp重組表達質(zhì)粒的篩選和表達常規(guī)方法培養(yǎng)Flp-In-CHO細胞,至對數(shù)生長期時,用25cm2細胞培養(yǎng)瓶將細胞按1∶4傳代,培養(yǎng)至細胞長成50%~70%單層時棄去培養(yǎng)液,用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞2次,利用脂質(zhì)體法將上述鑒定正確的重組表達質(zhì)粒和編碼Flp重組酶的輔助質(zhì)粒pOG44按照1∶9的摩爾比共轉(zhuǎn)染Flp-In-CHO細胞。用含400μg/ml潮霉素B的培養(yǎng)基篩選約15d后,獲得抗性細胞集落。挑取單個細胞集落,轉(zhuǎn)移至96孔細胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng),并分別進行有限稀釋法克隆,選擇生長狀態(tài)良好的細胞集落。1.5rhf基因融合在抗細胞群落中的確定采用PCR法。提取抗性細胞基因組DNA,利用引物F1/R1進行PCR鑒定,檢測目的基因FⅦ在Flp-In-CHO細胞中的整合情況。1.6pcr檢測ccdna采用RT-PCR法。提取細胞總RNA,采用RNAM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA:加入RNA10μl,引物Oligo(dT)151μl,70℃水浴5min,冰浴5min,再加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μl,5×反應緩沖液5μl,10mmol/LdNTPs2.5μl,RNasin1μl,42℃水浴1h后,置于70℃滅活5min。以合成的cDNA為模板,F1/R1為引物,進行PCR反應,反應條件同1.3項。以看家基因β-actin作為內(nèi)參照,其引物序列如下:上游(F2):5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′,下游(R2):5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。以pcDNA5/FRT/TO空載體轉(zhuǎn)染的細胞作為陰性對照。1.7小鼠sds-東南角的表達采用Westernblot法。選擇篩選獲得的抗性細胞株進行擴大培養(yǎng),收集細胞(密度為106個/ml)24h表達上清各25μl,進行12%SDS。采用半干電轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,再將膜置于含1%BSA的TBST緩沖液中,于4℃振蕩過夜;次日,依次加入小鼠抗hFⅦ單抗和HRP標記的羊抗鼠IgG,洗膜后,應用化學發(fā)光法進行顯色。以NovoSeven誖為陽性對照。1.8凝血激活酶活性測定采用PT法,按hFⅦ促凝活性檢測試劑盒說明操作:以FⅦ缺陷血漿為基質(zhì),在組織凝血激活酶和Ca2+的參與下,待檢樣品出現(xiàn)凝固所需的時間與其含量(FⅦ∶C)相關,測定不同稀釋度的參比血漿的凝固時間,繪制標準曲線,同時測定樣品的凝固時間,將數(shù)據(jù)代入標準曲線回歸方程,即可算出樣品中FⅦ相當于正常水平的百分率。1.8.1凝血時間測定cacl2將正常參比血漿用稀釋液倍比稀釋(1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80),其對應FⅦ∶C百分比活性為200%、100%、50%、25%、12.5%;將CaCl2和復溶后的PT試劑置于37℃保溫;取某一稀釋度的正常參比血漿0.1ml、凝血因子Ⅶ缺陷血漿0.1ml、PT試劑0.1ml,加入透明小試管中,混勻后置37℃保溫3min;迅速加入保溫的0.025mol/LCaCl2溶液0.1ml,在水浴中以1~2次/s的頻率搖動小試管,當出現(xiàn)凝固時,立刻記錄凝固時間;以不同稀釋度正常參比血漿FⅦ∶C百分活性為X軸,對應的凝固時間(s)為Y軸,繪制標準曲線,得到直線回歸方程。1.8.2樣品測定將樣品按同樣的方法測定并記錄凝固時間;將凝固時間(s)代入標準曲線方程,計算X值,即得樣品FⅦ∶C的百分活性水平。2.結(jié)果2.1gena工藝鑒定f基因的測序結(jié)果重組表達質(zhì)粒的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見約1300bp的DNA片段,與以pT-FⅦ為模板擴增出的基因片段相符,見圖1。PCR初步鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和EcoRⅤ雙酶切,可見約1300bp的DNA片段,與純化的FⅦ基因PCR產(chǎn)物一致,見圖2。測序結(jié)果與GenBank中登錄的hFⅦ基因序列同源性達99%。表明FⅦ基因已成功插入表達載體pcDNA5/FRT/TO中,將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒命名為pcDNA5/FRT/TO-FⅦ。2.2轉(zhuǎn)向細胞的篩選經(jīng)400μg/ml潮霉素B進行壓力篩選,共獲得9株抗性細胞,分別命名為CHO-FⅦ-01~09。2.3細胞內(nèi)dna片段的擴增9株抗性細胞的基因組DNA中均可擴增出約1300bp的DNA片段,大小與陽性對照一致,而以pcDNA5/FRT/TO空載體轉(zhuǎn)染的細胞基因組DNA,則未擴增出相應大小的DNA片段,見圖3。表明rhFⅦ基因已整合入CHO細胞的基因組中。2.4抗感細胞中rhf基因mrna的轉(zhuǎn)移水平RT-PCR結(jié)果表明,抗性細胞可以檢測到目的基因mRNA的轉(zhuǎn)錄,而空載體轉(zhuǎn)染的細胞未檢測到目的基因mRNA的轉(zhuǎn)錄,見圖4。2.5結(jié)合組成蛋白條帶Westernblot結(jié)果表明,抗性細胞表達上清中可見與陽性對照NovoSeven誖相對分子質(zhì)量一致的蛋白條帶,見圖5。通過Bandscan軟件分析各條帶的灰度,并進行對比,不同細胞株所表達的rhFⅦ水平接近,表達水平相對最高的細胞株表達量約為4mg/L。2.6回歸方程的建立和驗證將不同稀釋濃度的參比血漿中FⅦ的促凝活性[(FⅦ∶C(%)]及其對應的凝集時間(s)取對數(shù),見表1,分別作為X軸和Y軸坐標值,繪制標準曲線,得到回歸方程:logY=-0.24logX+2.1。在相同條件下測定篩選出的9個抗性細胞株表達上清的促凝時間,根據(jù)直線回歸方程計算樣品的相對比活性,見表2。結(jié)果表明,表達的rhFⅦ具有促凝活性,活性最高者相當于人正常血漿的7.94倍。3.外源蛋白表達系統(tǒng)擴增目前,建立高效表達藥用重組蛋白的哺乳動物細胞株主要是利用隨機整合的方法。然而,在哺乳動物細胞龐大的基因組中,隨機整合位點有15000個以上,其中位于轉(zhuǎn)錄活性區(qū)的位點只有15個左右,大量的隨機整合位點位于非轉(zhuǎn)錄活性區(qū)。這種“位置效應”造成目的蛋白的表達差異可達95%以上,篩選幾率為1/1000,存在研發(fā)周期長、成本較高等問題。位點特異性重組技術可快速而準確地將外源目的基因定點整合到細胞基因組中,從而獲得表達穩(wěn)定的細胞株,而且外源基因在各細胞株之間的表達水平接近。本研究所選用的Flp/FRT位點特異性整合表達系統(tǒng)主要包括:基因組轉(zhuǎn)錄活性區(qū)含有單一整合位點FRT的Flp-In-CHO細胞、含有FRT位點的pcDNA5/FRT/TO表達載體和輔助質(zhì)粒pOG44。其中表達載體的篩選標記Hygromycin基因的上游沒有起始密碼子ATG,因此只有實現(xiàn)位點特異性整合后,Hygromycin抗性基因才能在整合位點上游的起始密碼子和啟動子的調(diào)控下進行表達,從而賦予細胞抗潮霉素B的抗性;而當重組質(zhì)粒隨機整合進基因組非FRT位點時,細胞在篩選的過程中將會死亡。Flp-In-CHO細胞的這種特性,可使篩選獲得的不同抗性細胞株之間的表達水平十分接近。本實驗將攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ轉(zhuǎn)染Flp-In-CHO細胞,通過潮霉素B壓力篩選,獲得的細胞株在基因組、mRNA中均可檢測到FⅦ基因,表達上清中含有與陽性對照相對分子質(zhì)量一致的蛋白,說明目的基因已整合進入細胞基因組,并獲得表達。而且,各細胞株表達上清均有促凝活性,即細胞所表達的外源蛋白具有相應的生物學功能。運用Flp/FRT位點特異性整合系統(tǒng)篩選表達外源基因人r