大熊貓重要疾病檢測技術(shù)規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大熊貓重要傳染性疾病及寄生蟲病的病原檢測項(xiàng)目、病原檢測方法、病原檢測規(guī)則、結(jié)果判定和檢測結(jié)論、廢棄物處理等內(nèi)容和要求；本標(biāo)準(zhǔn)適用于XX省大熊貓轉(zhuǎn)運(yùn)、健康監(jiān)測、野外救護(hù)等病原檢測方案。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T18646-2018動(dòng)物布X氏菌診斷技術(shù)SN/T2123-2008出入境動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)樣品采集、運(yùn)輸和保存規(guī)范DB51/T1710.4-2013大熊貓檢疫技術(shù)-犬冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范-RT-PCR方法DB51/T1710.5-2013大熊貓檢疫技術(shù)-腸侵襲性大腸桿菌（EIEC.0152）的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范DB51/T1710.7-2013大熊貓檢疫技術(shù)-犬腺病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范-PCR方法DB51/T1710.9-2013大熊貓檢疫技術(shù)-蜱實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范DB51/T1710.10-2013大熊貓檢疫技術(shù)-蠕形螨實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范DB51/T1710.14-2013大熊貓檢疫技術(shù)-肺炎克雷伯氏桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范DB51/T1710.16-2013大熊貓檢疫技術(shù)-金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)規(guī)范DB51/T1710.18-2016大熊貓檢疫技術(shù)-乙型腦炎病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法DB51/T2387-2017大熊貓檢疫技術(shù)-弓形蟲檢疫技術(shù)規(guī)范DB51/T2389-2017大熊貓檢疫技術(shù)-隱孢子蟲檢測技術(shù)規(guī)程術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainReaction，PCR用一對寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTPs）為原料，在合適的溫度、離子條件和耐熱DNA聚合酶催化下，在體外人工合成特異的DNA片段的過程。反轉(zhuǎn)錄ReverseTranscription，RT是DNA生物合成的一種特殊方式，以RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄酶合成DNA。互補(bǔ)脫氧核糖核酸ComplementaryDNA，cDNA以信使核糖核酸為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄所得到的脫氧核糖核酸。病原微生物PathogenicMicroorganism指可以侵犯機(jī)體，引起感染的微生物。病原微生物指朊毒體、真菌、細(xì)菌、螺旋體、支原體、立克次體、衣原體、病毒。寄生蟲Parasite指具有致病性的低等真核生物，為在宿主或寄主體內(nèi)或附著于體外以獲取維持其生存、發(fā)育或者繁殖所需的營養(yǎng)或者庇護(hù)的一切生物。主要儀器低溫冰箱。生物安全柜。超凈工作臺(tái)。渦旋振蕩器?？烧{(diào)微量加樣槍。高速離心機(jī)。PCR儀。電泳儀。凝膠成像系統(tǒng)。恒溫培養(yǎng)箱。恒溫?fù)u床。生物顯微鏡。水浴鍋。高壓滅菌鍋。病原檢測項(xiàng)目病原微生物必須檢測項(xiàng)目犬瘟熱病毒CanineDistemperVirus貓泛白細(xì)胞減少癥病毒FelinePanleukopeniaVirus輪狀病毒Rotavirus金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus侵襲性大腸桿菌Enterinvasive

E.coli布氏桿菌Brucella必要時(shí)補(bǔ)充檢測項(xiàng)目犬腺病毒CanineAdenovirus犬冠狀病毒CanineCoronavirus乙型腦炎病毒EncephalitisBVirus肺炎克雷伯菌KlebsiellaPneumoniae寄生蟲必須檢測項(xiàng)目巴貝斯蟲Babesia西氏貝蛔蟲Baylisascarisschroederi蜱蟲Ixodidae必要時(shí)補(bǔ)充檢測項(xiàng)目隱孢子蟲Cryptosporidium蠕形螨Demodex弓形蟲Toxoplasmagondii病原檢測方法病原微生物犬瘟熱病毒，檢測核酸，方法見附錄A；輪狀病毒，檢測核酸，方法見附錄B；貓泛白細(xì)胞減少癥病毒，檢測核酸，方法見附錄C；犬腺病毒，檢測核酸，方法見DB51/T1710.7-2013；犬冠狀病毒，檢測核酸，方法見DB51/T1710.4-2013；乙型腦炎病毒，檢測核酸，方法見DB51/T1710.18-2016；金黃色葡萄球菌，檢測核酸和病原菌，方法見DB51/T1710.16-2013；侵襲性大腸桿菌，檢測核酸和病原菌，方法見DB51/T1710.5-2013；布氏桿菌，檢測抗體，方法見GB/T18646-2018；肺炎克雷伯菌，檢測核酸和病原菌，方法見DB51/T1710.14-2013；寄生蟲巴貝斯蟲，檢測核酸和顯微鏡觀察，方法見附錄D；西氏貝蛔蟲，檢測核酸和顯微鏡觀察，方法見附錄E；隱孢子蟲，檢測核酸和顯微鏡觀察，方法見DB51/T2389-2017；蜱蟲，顯微鏡觀察，方法見DB51/T1710.9-2013；蠕形螨，顯微鏡觀察，方法見DB51/T1710.10-2013；弓形蟲，檢測核酸和顯微鏡觀察，方法見DB51/T2387-2017。病原檢測規(guī)則7.1采樣方式樣品的采集、運(yùn)輸和保存按照SN/T2123-2008《出入境動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)樣品采集、運(yùn)輸和保存規(guī)范》執(zhí)行。按照病原檢測（病毒、細(xì)菌、寄生蟲）所需樣品要求聯(lián)合取樣。在行為訓(xùn)練條件下非麻醉或者麻醉狀態(tài)下采集大熊貓的糞便、肛拭子、口咽拭子、鼻拭子、血液、毛發(fā)或皮屑、乳汁或胸腹水等樣本。7.2送檢要求樣品和樣品送檢單需盡快送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，如實(shí)、詳細(xì)填寫樣品送檢單上的動(dòng)物信息（個(gè)體譜系號或呼名）、樣品名稱、采樣日期、數(shù)量、檢測項(xiàng)目等內(nèi)容。如不能立即送檢，則樣品需根據(jù)不同的檢測項(xiàng)目選擇相應(yīng)的保存方式。檢測病原核酸的樣本應(yīng)保存在-20℃或-80℃冰箱內(nèi)，細(xì)菌培養(yǎng)和寄生蟲鏡檢樣品需4℃保存，在48h內(nèi)送檢。結(jié)果判定及結(jié)論根據(jù)使用的試劑及方法說明，進(jìn)行結(jié)果判斷；未見陽性結(jié)果，判斷為陰性結(jié)果；出現(xiàn)陽性或可疑結(jié)果時(shí)，應(yīng)在使用一個(gè)療程藥物治療或間隔2個(gè)潛伏期后進(jìn)行二次檢測，二次檢測結(jié)果為陽性或可疑結(jié)果時(shí)判定為陽性。根據(jù)檢測結(jié)果出具檢測報(bào)告，檢測報(bào)告應(yīng)包括動(dòng)物信息、樣本信息、檢測方法、檢測結(jié)果和結(jié)論。廢棄物處理廢棄物處理按照GB/T19489-2008《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》7.19執(zhí)行。

（規(guī)范性附錄）

大熊貓犬瘟熱病毒反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測方法A.1樣品采集與處理樣本為大熊貓的口咽拭子或新鮮糞便，采集后立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測。樣品的采集、運(yùn)輸和保存按照SN/T2123-2008《出入境動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)樣品采集、運(yùn)輸和保存規(guī)范》執(zhí)行。A.2待測樣品RNA提取及反轉(zhuǎn)錄將樣品按照病毒RNA提取試劑盒的操作說明提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系見表A.1。表A.1犬瘟熱病毒的反轉(zhuǎn)錄體系組分加入體積（μL）總RNA28AMVBuffer1010MmdNTP7RandomPrimer（N9/N6）1Oligod（T）Primer1AMVreversetranscriptase2RRI1total50室溫孵育10min，42℃水浴1~1.5h。A.3RT-PCR反應(yīng)引物參照地方標(biāo)準(zhǔn)引物上游引物（5’-3’）：CGAGTCTTTGAGATAGGGTT下游引物（5’-3’）：CCTCCAAAGGGTTCCCATGAA.4對照設(shè)立陽性對照：取已知犬瘟熱病毒陽性cDNA作為陽性對照；陰性對照：以滅菌雙蒸水作為陰性對照。A.5RT-PCR反應(yīng)體系及條件A.5.1RT-PCR反應(yīng)體系見表A.2。表A.2犬瘟熱病毒的RT-PCR反應(yīng)體系組分加入體積（μL）2×TaqPCRMastermix12.5上游引物1下游引物1cDNA模板2ddH2O8.5總體系25A.5.2RT-PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性3min后循環(huán)開始，95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸7min。A.5.3RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小產(chǎn)物大小：454bp。A.5.4RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測取PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物，經(jīng)1.2%X脂糖凝膠電泳檢測（120V，30min），通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。A.6結(jié)果判定陽性對照出現(xiàn)454bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)成立；待檢樣品出現(xiàn)454bp目的片段時(shí)，判定犬瘟熱病毒陽性；未出現(xiàn)454bp目的片段時(shí)，判定犬瘟熱病毒陰性。

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大熊貓輪狀病毒反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測方法B.1樣品采集與處理樣本為大熊貓的肛拭子或新鮮糞便樣品，采集后立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測。樣品的采集、運(yùn)輸和保存按照SN/T2123-2008《出入境動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)樣品采集、運(yùn)輸和保存規(guī)范》執(zhí)行。B.2待測樣品RNA提取及反轉(zhuǎn)錄將樣品按照病毒RNA提取試劑盒的操作說明提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系見表B.1。表B.1輪狀病毒的反轉(zhuǎn)錄體系組分加入體積（μL）總RNA28AMVBuffer1010MmdNTP7RandomPrimer（N9/N6）1Oligod（T）Primer1AMVreversetranscriptase2RRI1total50反應(yīng)程序：37℃45min，85℃5s，4℃保存。B.3RT-PCR反應(yīng)引物上游引物（5’-3’）：TGGTATTGAATATACCACAAT下游引物（5’-3’）：AAGGATGGCCCACAGGATCAGB.4對照設(shè)立陽性對照：取已知輪狀病毒陽性質(zhì)粒cDNA作為陽性對照；陰性對照：以滅菌雙蒸水作為陰性對照。B.5RT-PCR反應(yīng)體系及條件B.5.1RT-PCR反應(yīng)體系見表B.2。表B.2輪狀病毒的PCR反應(yīng)體系組分加入體積（μL）2×TaqPCRMastermix12.5上游引物1下游引物1cDNA模板2ddH2O8.5總體系25B.5.2RT-PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min后循環(huán)開始，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸10min。B.5.3RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小產(chǎn)物大?。?40bp。B.5.4RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測取PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物，經(jīng)1.2%X脂糖凝膠電泳檢測（120V，30min），通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。B.6結(jié)果判定陽性對照出現(xiàn)340bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)成立；待檢樣品出現(xiàn)340bp目的片段時(shí)，判定輪狀病毒陽性；未出現(xiàn)340bp目的片段時(shí)，判定輪狀病毒陰性。

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大熊貓貓泛白細(xì)胞減少癥病毒巢式PCR檢測方法C.1樣品采集與處理樣本為大熊貓的肛拭子和糞便樣品，采集后立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原檢測。樣品的采集、運(yùn)輸和保存按照SN/T2123-2008《出入境動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)樣品采集、運(yùn)輸和保存規(guī)范》執(zhí)行。C.2待測樣品DNA提取及反轉(zhuǎn)錄將樣品按照DNA提取試劑盒的操作說明提取DNA。C.3巢式PCR反應(yīng)引物C.3.1NS1巢式PCR反應(yīng)引物根據(jù)NS1基因序列設(shè)計(jì)外套：上游引物（5’-3’）：CATGGACCAGCAAGTACAGG下游引物（5’-3’）：CAGTGCAAGGTCCACTACGT內(nèi)套：上游引物（5’-3’）：AGCTGGTAACTTTGGTCAAC下游引物（5’-3’）：GGATTGTTTGCCGCTTGTGTC.3.2VP1巢式PCR反應(yīng)引物根據(jù)VP1基因序列設(shè)計(jì)外：上游引物（5’-3’）：GAACACGACGAAGCTTACGC下游引物（5’-3’）：AGCTGCTGGAGTAAATGGCA內(nèi)：上游引物（5’-3’）：TTCTCGCCAGCAGATCAACG下游引物（5’-3’）：CTCCCCAAGCATTTGCATCAC.4對照設(shè)立陽性對照：取已知貓泛白細(xì)胞減少癥病毒疫苗DNA作為陽性對照；陰性對照：以滅菌雙蒸水作為陰性對照。C.5PCR反應(yīng)體系及條件C.5.1PCR反應(yīng)體系NS1基因外套反應(yīng)體系見表C.1。表C.1NS1基因外套反應(yīng)體系組分加入體積（μL）2×TaqPCRMastermix10上游引物0.5下游引物0.5DNA模板1ddH2O8總體系20NS1基因內(nèi)套反應(yīng)體系見表C.2。表C.2NS1基因內(nèi)套反應(yīng)體系組分加入體積（μL）2×TaqPCRMastermix10上游引物0.8下游引物0.8DNA模板0.4ddH2O18總體系30VP1基因外套反應(yīng)體系見表C.3。表C.3VP1基因外套反應(yīng)體系組分加入體積（μL）2×TaqPCRMastermix10上游引物0.5下游引物0.5DNA模板1ddH2O8總體系20VP1基因內(nèi)套反應(yīng)體系見表C.4。表C.4VP1基因內(nèi)套反應(yīng)體系組分加入體積（μL）2×TaqPCRMastermix12上游引物0.8下游引物0.8DNA模板0.5ddH2O15.9總體系30C.5.2PCR反應(yīng)條件NS1基因外套：95℃預(yù)變性5min后循環(huán)開始，95℃變性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸50s，共31個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5min。NS1基因內(nèi)套：95℃預(yù)變性5min后循環(huán)開始，95℃變性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸40s，共31個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5min。VP1基因外套：95℃預(yù)變性5min后循環(huán)開始，95℃變性30s，55.5℃退火40s，72℃延伸1min，共31個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸7min。VP1基因內(nèi)套：95℃預(yù)變性5min后循環(huán)開始，95℃變性30s，60.5℃退火30s，72℃延伸50s，共31個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5min。C.5.3產(chǎn)物大小NS1基因產(chǎn)物大小：435bp。VP1基因產(chǎn)物大?。?07bp。C.5.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測取PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物，經(jīng)1.2%X脂糖凝膠電泳檢測（120V，30min），通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。C.6結(jié)果判定NS1基因檢測陽性對照出現(xiàn)435bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)成立；VP1基因檢測陽性對照出現(xiàn)607bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)成立；待檢樣品同時(shí)出現(xiàn)435bp、607bp目的片段時(shí)，判定貓泛白細(xì)胞減少癥病毒PCR檢測陽性；未出現(xiàn)435bp、607bp目的片段時(shí)，判定貓泛白細(xì)胞減少癥病毒PCR檢測陰性；僅出現(xiàn)一個(gè)目的條帶時(shí)，判定貓泛白細(xì)胞減少癥病毒PCR檢測疑似陽性，經(jīng)基因測序后以測序比對結(jié)果為準(zhǔn)。

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大熊貓?jiān)窗拓愃瓜x檢測方法D.1顯微鏡鏡檢D.1.1樣品采集在訓(xùn)練或麻醉狀態(tài)下采集大熊貓靜脈血至EDTA抗凝管，輕柔混勻血液和抗凝劑，備用。D.1.2血涂片編號準(zhǔn)備載玻片并在磨砂面一端標(biāo)上動(dòng)物姓名、采樣日期和樣品編號。D.1.3血涂片制備D.1.3.1厚血膜的制備取1張已消毒的載玻片，將4~5μL血液滴至載玻片上，取另一載玻片一端接觸血液，由里向外旋轉(zhuǎn)，涂成圓形厚血膜，自然晾干。D.1.3.2薄血膜的制備取1張已消毒的載玻片，用毛細(xì)管吸取抗凝血滴至載玻片上一滴，取另一載玻片作為推片，推片的邊緣緊貼載玻片，接觸血液，使血沿推片的邊緣散開，兩張玻片保持25°~35°角，將推片向前推成舌狀薄血膜，自然晾干。D.1.4血涂片染色常用的巴貝斯蟲染色液為DiffQuick染色液，按照說明書進(jìn)行血涂片染色，自然晾干后待檢。D.1.5顯微鏡觀察及結(jié)果判定將染色后的血涂片放置在顯微鏡下，先低倍找到視野，再調(diào)整至10×（倍）、100×（倍）目鏡下檢查，在紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)巴貝斯蟲則判定為陽性。D.2核酸檢測D.2.1樣本采集在訓(xùn)練或麻醉狀態(tài)下采集大熊貓靜脈血至EDTA抗凝管，輕柔混勻血液和抗凝劑，收集全血200μL，備用。D.2.2待測樣本DNA的提取與保存按照DNA提取試劑盒的操作說明提取樣本DNA，凍存于-80℃冰箱備用。D.2.3對照設(shè)立陽性對照：取已知巴貝斯蟲陽性質(zhì)粒DNA作為陽性對照；陰性對照：以滅菌雙蒸水作為陰性對照。D.2.4PCR反應(yīng)引物根據(jù)巴貝斯蟲18SrRNA基因序列設(shè)計(jì)以下引物：上游引物（5’-3’）：GTCTTGTAATTGGAATGATGG下游引物（5’-3’）：TAGTTTATGGTTAGGACTACGD.2.5PCR反應(yīng)體系及條件D.2.5.1PCR反應(yīng)體系見表D.1。表D.1巴貝斯蟲PCR反應(yīng)體系組分加入體積（μL）2×TaqPCRMastermix12.5上游引物1.0下游引物1.0DNA模板2.0ddH2O8.5總體系25.0D.2.5.2PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min后循環(huán)開始，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸10min。D.2.6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小產(chǎn)物大?。?65bp。D.2.7PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測取PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物，經(jīng)1.2%X脂糖凝膠電泳檢測（120V，30min），通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。D.3結(jié)果判定陽性對照出現(xiàn)465bp的目的片段，陰性對照無條帶，實(shí)驗(yàn)成立；待檢樣品出現(xiàn)465bp目的片段時(shí)，判定巴貝斯蟲陽性；未出現(xiàn)465bp目的片段時(shí)，判定巴貝斯蟲陰性。

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大熊貓西氏貝蛔蟲檢測方法E.1糞便檢查樣本采集收集大熊貓新鮮糞便，放置4℃保存待用。E.1.2漂浮法A）漂浮法使用的溶液配制：將氯化鈉或者硫酸鎂緩慢加入盛有沸水的容器內(nèi)，攪拌，直至氯化鈉或者硫酸鎂不再溶解為止，冷卻后盛裝，備用；B）用竹簽挑取黃豆粒大小的糞便于圓形直筒瓶（高約3.5cm，直徑2cm）中；C）加入飽和鹽水或者硫酸鎂水，當(dāng)液面接近瓶口時(shí)改用滴管滴加，使液面略高于瓶口又不溢出為止；D）在瓶口覆蓋載玻片，靜止15min~20min后鏡檢。E.1.3改良加藤厚涂片法A）透明液配制:量取蒸餾水和純甘油各100mL，混合后，再加入3%孔雀綠或亞甲基藍(lán)1mL，儲(chǔ)瓶備用；B）取親水玻璃紙（25mm×40mm×40μm）放入透明液中浸泡24h以上即可使用；C）將尼龍絹片（8cm×8cm）置于糞便標(biāo)本上，使糞渣通過尼龍絹片