青蒿琥酯和雷帕霉素對類風濕性關節(jié)炎的緩解作用

蠕蟲炎是一種慢性、進展性和系統(tǒng)性疾病，主要是滑膜炎，其早期癥狀是滑膜炎，最終導致關節(jié)軟骨和骨骼的損傷，導致關節(jié)變形和運動的受限?；ぱ椎某霈F與滑膜細胞增生和血管痙攣有關。它的機制是分泌大量激素，并釋放各種基本金屬酶。雖然ra的病因尚不清楚，但在過去60年中，使用緩解癥狀的抗生素藥物（mdark）治療后，ra的治療效果明顯，副作用明顯，無法治愈。隨著英偉單抗（infelticiab）和阿達穆單銀（adalimmab）等腫瘤壞死因素的uf061（tnfuf061）單克隆抗體得到認可，大多數接受治療的ra患者的病情有所改善，關節(jié)損傷程度也有所減輕。然而，根據臨床數據，tnf061單一抗抗劑的有效治療效果非常差。同時，tnf061失去了活力，干擾了身體的正常免疫防御功能，增加了患者受到病原體感染的風險。此外，tnf061的有效治療不能修復關節(jié)和愈合損傷。因此，為了為不接受tnf61抗炎劑的患者提供更多的治療方法，有必要開發(fā)基于發(fā)病機制的ra治療藥物。由于RA初期的滑膜血管新生和細胞增殖類似于腫瘤的部分特征,因此預期細胞凋亡誘導劑對阻止滑膜增生有效.Hultqvist等人用活性氧(ROS)誘導劑植醇治療佐劑誘導的關節(jié)炎大鼠,結果發(fā)現ROS發(fā)生增強,自身免疫應答減弱,可同時改善關節(jié)炎的急性期及慢性期癥狀.同樣,考慮到青蒿琥酯能誘導腫瘤細胞凋亡[5~7],有理由將其用作抗RA藥物.Xu等人發(fā)現,青蒿琥酯可通過阻斷NF-uf06bB和P13激酶/Akt信號通路抑制RA患者纖維母細胞樣滑膜細胞增殖.He等人也證明青蒿琥酯能下調與血管形成有關的缺氧誘導因子-1uf061(HIF-1uf061)和血管內皮生長因子(VEGF)表達.另一種青蒿素衍生物SM905被Wang等人證實能通過阻遏炎癥反應及Th17應答使DBA/1小鼠關節(jié)炎明顯好轉.上述結果表明,青蒿琥酯不僅能通過誘導細胞凋亡抑制滑膜炎發(fā)作,而且還能以非細胞凋亡方式發(fā)揮其抗炎作用.另一方面,哺乳類雷帕霉素靶點(mTOR)在多種癌癥中均被發(fā)現活性上調[11~13],而mTOR抑制劑雷帕霉素(sirolimus或everolimus)可用于晚期視網膜細胞瘤、難治性套細胞淋巴瘤、進展性晚期神經內分泌瘤治療[14~16].由此推測,雷帕霉素對關節(jié)炎也應當有效.Glantschnig等人發(fā)現,sirolimus在離體條件下能防止關節(jié)骨骼消融,其機理是抑制破骨細胞中S6蛋白、S6激酶和4E-BP1的磷酸化.Kneissel等人報道,通過抑制cathepsinK表達及成骨細胞活性,everolimus可阻斷卵巢切除術誘導的大鼠關節(jié)骨骼成分丟失.Laragione等人發(fā)現,雷帕霉素通過降低mTOR及其底物p70S6K1和4EBP的磷酸化,可減少降植烷誘導關節(jié)炎中纖維母細胞樣滑膜細胞對關節(jié)軟骨及骨骼的侵蝕.Cejka等人也報道,在患有慢性炎癥性及破壞性關節(jié)炎的轉人TNFuf061基因小鼠中,sirolimus或everolimus可下調消化酶類表達及促進破骨細胞凋亡,借此減少滑膜破骨細胞形成,并保護關節(jié)避免骨骼侵蝕和軟骨損失.盡管Nagy曾推測一氧化氮(NO)可能是RA的關鍵致病因素,但迄今對于NO如何誘導RA仍然一無所知,而且以往闡述的青蒿琥酯及雷帕霉素治療機理從未涉及對NO的抑制作用.為了探討RA的發(fā)病原因并闡明青蒿琥酯和雷帕霉素的抗RA機理,本研究通過小鼠關節(jié)內注射完全弗氏佐劑(CFA)建立了完全模擬膠原誘導關節(jié)炎(CIA)的CFA誘導急性關節(jié)炎(CIAA)模型,并利用此模型初步驗證“NO爆發(fā)性缺氧誘導關節(jié)滑膜炎”的假說,由此證實NO在實驗性RA造模中的關鍵作用.本研究得出的有關青蒿琥酯和雷帕霉素抗關節(jié)滑膜炎的實驗動物活體藥理評價結果,將為未來進一步開展新的非抗體類RA治療藥物的臨床試驗打下良好的基礎.1材料和方法1.1cea模型的建立SPF級昆明小鼠(7~8周齡,雌雄各半,體重20~22g)由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,動物實驗方案經廣州中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準(許可證編號:SPF-2011C007).在CIA模型制備中,將膠原Ⅱ(CⅡ,購自Sigma-Aldrich)溶于0.1mol/L乙酸中.在CⅡ溶液中加入等體積CFA(Sigma-Aldrich)溶液乳化.取CⅡ-CFA乳化液于小鼠尾基部皮下多點注射,并在初次免疫后3周用相同CⅡ-CFA混合液加強免疫1次.為建立CIAA模型,將CFA溶液(2mg/mL)直接注射于小鼠后腿單側踝關節(jié)腔內.炎癥程度分級采用0~4分制:0=正常;1=一趾或多趾紅腫;2=自踝關節(jié)至中爪(跗骨)發(fā)紅并中度腫脹;3=自踝關節(jié)至中跗骨關節(jié)發(fā)紅并重度腫脹;4=踝、爪、趾全部紅腫,關節(jié)變形和僵硬.1.2雙蒸水注射注射用硝普鈉(SNP)粉劑(北京雙鶴現代醫(yī)藥技術有限公司)、NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)(碧云天生物技術研究所)均溶于無菌雙蒸水中,并過濾除菌,用于踝關節(jié)腔內注射給藥;青蒿琥酯(桂林南藥股份有限公司)用5%碳酸氫鈉配制,過濾除菌,現配現用,為肌肉注射給藥.雷帕霉素(LCLaboratories)用無水乙醇配制,為肌肉注射給藥.1.3血清no、la、spo2值的測定血清NO(NO3-/NO2-)含量及LA含量測定均使用國產試劑盒(南京建成生物工程研究所),并按廠家提供的說明書操作.將全血與生理鹽水等體積混合,于8000r/min離心10min,反應完畢后,在550nm波長處測定反應液的光吸收值(A550),根據下式計算血清NO濃度:NO(uf06dmol/L)=(A550測定管-A550空白管/A550標準管-A550空白管)×C標準管(20uf06dmol/L)×稀釋倍數.將全血與0.6mL蛋白質沉淀劑混合,于4000r/min離心8min,反應完畢后,在530nm波長處測定反應液的光吸收值(A530),由下式計算血清LA濃度:LA(mmol/L)=(A530測定管-A530空白管/A530標準管-A530空白管)×C標準管(3mmol/L)×稀釋倍數.采用國產便攜式血氧儀(北京超思電子有限公司)測定關節(jié)部位的SpO2值,將待測小鼠單腿置于測定槽,將膝關節(jié)對準光線射出孔,記錄LED屏上顯示的讀數,即為SpO2(%).1.4半定量分析將福爾馬林固定和石蠟包埋關節(jié)組織(含滑膜及軟骨)切成3uf06dm薄片,用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蒸餾水洗滌.經蘇木精染色后,用1%酸性乙醇分化、1%氨水返藍、95%乙醇沖洗.伊紅染色后,經梯度乙醇脫水和二甲苯清洗,用含二甲苯的封片液封片.在裝備照相機的顯微鏡下,采用非數值計分系統(tǒng)對組化染色切片進行半定量分析:0,+,++,+++,++++分別表示正常、滑膜增生、滑膜下組織纖維化、淋巴浸潤、關節(jié)損傷.將石蠟切片與3%H2O2在室溫下共育,以抑制內源性過氧化物酶,然后用煮沸的檸檬酸修片.經磷酸緩沖液(PBS)洗滌后,用2%牛血清白蛋白(BSA)封片,再與1:100稀釋的一抗在37℃下保溫1h.將玻片用PBS洗滌后,與生物素化二抗在37℃下保溫20min,再用PBS洗滌,與二氨基聯苯胺(DAB)保溫1~5min.先用自來水沖洗,再用蘇木精復染.經脫水、清洗和封片后,用配置OLYMUPUSBX-51數碼相機的MIAS顯微圖像分析系統(tǒng)(北京炳洋)進行免疫組化分析,由下式計算結果:免疫組化強度=陽性目標總面積/統(tǒng)計場總面積(面密度)×陽性目標的陽性單位(PU).1.5pcr芯片分析炎癥相關細胞因子抗體芯片分析及缺氧響應基因PCR芯片分析由上?？党缮锕こ逃邢薰緟f作完成.抗體芯片分析采用RayBio?MouseCytokineAntibodyArray試劑盒,步驟包括:蛋白質抽提、蛋白質定量、細胞因子檢測(封閉和孵育、檢測、圖像和數據采集).PCR芯片分析采用RT2ProfilerTMPCRArrayMouseHypoxiaSignalingPathway試劑盒,步驟包括:RNA抽提、DNA酶Ⅰ消化、RNA純化、RNA質量檢測、cDNA合成、實時定量PCR、數據分析.1.6測試結果及統(tǒng)計學分析除非特別指明,用于統(tǒng)計學分析的數據均來自實驗分組(n=3)內測定結果的均值±標準差抗體芯片及PCR芯片數據僅為單個樣品的分析結果.全部數據的統(tǒng)計學差異采用SPSS10.0(Windows版)軟件進行分析.2結果2.1csa和csa在小鼠關節(jié)內注射c-fps、c、f、f-b模型中的表達經肌內注射CⅡ-CFA建立的經典CIA小鼠模型,其炎癥表型是腿部、足部和腳趾出現肉眼可辨的紅腫現象(圖1A),在組織病理學圖譜上可見明顯的滑膜細胞增生和淋巴細胞浸潤(圖1B).相應地,經關節(jié)內注射CⅡ-CFA或CFA建立的CIAA模型也顯示出與CIA模型相類似的形態(tài)學和組織學損傷(圖1C~F).從圖中可以看出,經CⅡ-CFA或CFA注射后,踝關節(jié)部位的腫脹程度較明顯,單爪的炎癥計分可達3分(整個腿部重度紅腫),而且其組織損傷程度也已達到+++級(滑膜增生和炎性浸潤).經典的CIA模型是將CⅡ-CFA點狀注射于小鼠尾根部,造模時間長達28天.利用關節(jié)內注射CⅡ-CFA或CFA進行造模只需3天,令造模時間大大縮短.同時,大規(guī)模CⅡ-CFA造模組(n=15)或CFA造模組(n=15)的造模成功率高達100%,表明本研究建立的CIAA造模方法代表了目前最快捷、最有效的小鼠早期RA造模方法之一.為闡明關節(jié)發(fā)炎與免疫激活的相關性,在CFA免疫前后分別對血清中的細胞因子進行了抗體芯片分析(表1).結果顯示,CIAA小鼠與對照小鼠相比,在所測定的全部40種細胞因子中,共有31種細胞因子上調,其中幾種關鍵的促炎癥細胞因子均顯著上調,包括IL-6(2.78倍),MIP-1uf061(2.59倍),TNFuf061(2.24倍),GM-CSF(1.92倍),GCSF(1.76倍),INFuf067(1.5倍),IL-1uf062(1.46倍),MCSF(1.39倍).以上結果表明,小鼠關節(jié)內注射CFA可以廣泛激活促炎癥細胞因子,進而開啟后續(xù)炎癥應答事件.因此,CFA誘導關節(jié)炎的第一步是全身性免疫激活.2.2fps性免疫反應對pahss-rendth小鼠血清no、spo2、spo2水平的影響為闡明免疫激發(fā)與組織供氧的關系及其NO在其中所起的作用,對血清中的NO及關節(jié)部位的SpO2進行了連續(xù)跟蹤測定.結果顯示,在關節(jié)內注射CFA之后的第一天即可測到NO釋放入血,第二天出現NO劇烈爆發(fā)而形成NO峰,第三天NO峰值開始下降.CIAA小鼠與對照小鼠血清NO水平的最大差異接近2倍(圖2A).相應地,在CFA注射后還可同步出現SpO2的下降,對照小鼠中SpO2的最大值高于80%,而CIAA小鼠中SpO2的最小值低于60%(圖2B).由此可見,NO升高可導致SpO2下降,暗示NO與SpO2呈反相關.換言之,CIAA造模過程中CFA免疫激發(fā)產生的NO可能直接導致關節(jié)部位供氧不足及滑膜組織缺氧.2.3不同免疫組化對血管la對CIAA小鼠滑膜組織中的HIF-1uf061和VEGF進行了免疫組化定量測定.結果顯示,HIF-1uf061和VEGF均在CFA免疫后出現不同程度的上調,HIF-1uf061比VEGF的免疫組化染色強度更高(圖3A和B).在滑膜組織中,還可清晰地見到血管新生現象(圖3C).這一結果表明,CFA免疫激發(fā)的NO通過誘導滑膜缺氧可上調HIF-1uf061和VEGF表達,而HIF-1uf061與VEGF的激活即可啟動滑膜組織的血管新生過程.作為重要的缺氧指標之一,血清LA水平也在CFA注射的第一天起出現輕微升高,隨后不斷下降(圖3D).由此推測,因NO爆發(fā)性缺氧引起的無氧代謝致使LA出現短暫升高,由此誘導HIF-1uf061和VEGF表達及新生血管大量形成.隨著新血管的形成及供氧狀況的改善,無氧代謝活動受到抑制,于是血清LA水平隨之持續(xù)下降.2.4no在關節(jié)滑膜炎中的應用為進一步確認NO就是關節(jié)滑膜炎的啟動因素,利用NO供體化合物SNP注射小鼠關節(jié)腔,并在連續(xù)注射3天后觀察關節(jié)腫脹情況,并與關節(jié)內注射CⅡ-CFA及SNP+CⅡ-CFA的小鼠進行比較.結果顯示,SNP能模擬CIAA小鼠的關節(jié)炎癥表型,單爪的炎癥程度可計2分,比2mg/mL及200uf06dg/mLCⅡ-CFA處理誘導的炎癥(計3分)稍低,但高于20uf06dg/mLCⅡ-CFA處理誘導的炎癥(僅計1分).在相同濃度下,SNP+CⅡ-CFA合并處理與CⅡ-CFA單獨處理的炎癥計分無明顯差異,可能原因是SNP+CⅡ-CFA與CⅡ-CFA的注射量均為200uf06dL,合用時CⅡ-CFA濃度已減半(圖4).以上結果顯示,無論NO的來源如何,它都扮演著啟動關節(jié)滑膜炎的關鍵角色.為從反面證實NO在關節(jié)滑膜炎中的啟動作用,用NO合成抑制劑L-NMMA與CFA聯合注射后,觀察了小鼠關節(jié)部位的腫脹情況.結果表明,不同劑量及不同部位(左后腿或右后腿)注射CFA均可引起關節(jié)腫脹,而且炎癥程度較高(計3分)(圖5A~C).若注射CFA又同時注射L-NMMA,則不出現明顯的關節(jié)腫脹(圖5D和E).但是,在兩條后腿的踝關節(jié)腔內均注射CFA,而僅在一條后腿的踝關節(jié)腔內注射L-NMMA,還是會在兩條后腿上出現關節(jié)腫脹,只不過注射L-NMMA者腫脹較輕微(圖5F).對各小鼠關節(jié)部位的SpO2測定結果表明,CFA注射后關節(jié)部位對應于較低的SpO2值,而CFA+L-NMMA注射后關節(jié)部位對應于較高的SpO2值(表2),表明L-NMMA可以通過抑制NO合成而改善關節(jié)部位的供氧狀況,從而緩解關節(jié)滑膜炎癥狀.2.5血清炎癥基因表達水平滑膜細胞缺氧信號基因表達PCR芯片分析表明,CⅡ-CFA及CⅡ-CFA+SNP均能上調NOS2基因表達(2~4倍),而SNP下調NOS2基因表達(3倍),表明SNP釋放的NO對NOS2基因有阻遏作用.同時,無論CⅡ-CFA誘導產生的內源NO或SNP釋放的外源NO,均能上調免疫應答基因的表達,這些基因包括IL-1a,IL-6,NOTCH1基因等(表3).這些結果與前述CⅡ-CFA注射上調促炎癥細胞因子表達的抗體芯片分析結果相吻合.由上表還可見,缺氧響應基因(ANGPTL4,ARNT2,CREBBP,EP300,HIF-1a,MT3,PRKAA1)、氧化應激響應基因(CAT,CYGB,GPX1)及其他與應激響應有關的基因(ADM,EPO,HYOU1,VEGF)等的誘導表達水平偏低,表明這些基因的表達在SNP注射后3天內尚未出現明顯升高.另外,快骨骼肌可磷酸化肌球蛋白輕鏈基因(Mylpf)分別被SNP,CII-CFA,SNP+CⅡ-CFA下調1000,50和15倍,其生理意義暫不明確.為闡明SNP,CⅡ-CFA,CFA單用或聯用對缺氧響應基因表達在較長時間內的調控作用,利用不同濃度的SNP,CⅡ-CFA,SNP+CⅡ-CFA,CFA,SNP+CFA注射小鼠背部皮下組織,并在12天后對HIF-1uf061和VEGF進行免疫組化分析.測定結果表明,隨著SNP濃度逐漸增加,HIF-1uf061和VEGF表達水平不斷升高,其中以100uf06dg/mLSNP處理的表達水平最高,HIF-1uf061約為對照的7倍,而VEGF約為對照的4倍(表4).由上表還可看出,SNP,CⅡ-CFA,CFA單用都能上調HIF-1uf061和VEGF表達,但聯用并未在單用的基礎上提高HIF-1uf061和VEGF的表達水平,這可能是因為聯用時SNP使用濃度(100uf06dg/mL)低于單用時濃度(50uf06dg/mL)的緣故.2.6青蒿表現對減少前注射限制后小鼠血清no水平的影響在CFA免疫前4h,于小鼠皮下注射青蒿琥酯或雷帕霉素,并在CFA免疫后繼續(xù)注射(每天2次,連續(xù)注射3天),然后分析青蒿琥酯或雷帕霉素對CIAA造模過程中促炎癥細胞因子表達的影響.結果表明,僅雷帕霉素對CFA誘導的免疫激活具有較強的抑制作用,而青蒿琥酯并未對CFA的誘導表現出明顯的免疫抑制效應(表5).雷帕霉素使INFuf067,IL-1uf061和IL-6等促炎癥細胞因子的表達水平分別下降至CFA免疫小鼠的70%,85%和82%,而青蒿琥酯則使上述促炎癥細胞因子的表達水平略有升高,分別為CFA免疫小鼠的1.46,1.41和1.79倍.由上表還可看出,經青蒿琥酯或雷帕霉素注射的CIAA小鼠,其TNFuf061及可溶性TNFuf061受體(sTNFRⅠ,sTNFRⅡ)的表達水平均比未注射藥物的CIAA小鼠稍高(1~2倍),這說明青蒿琥酯或雷帕霉素對TNFuf061及其受體表達無抑制作用.將小鼠CIAA模型的治療分成造模前給藥組(CFA免疫前4h開始注射,每天注射2次,連續(xù)注射3天)和造模后給藥組(CFA免疫后開始注射,每天注射2次,連續(xù)注射5天),觀察青蒿琥酯或雷帕霉素對血清NO水平的調節(jié)作用.在前處理組中,經青蒿琥酯或雷帕霉素注射3天后,其血清NO水平下降到與對照相當的水平;在后處理組中,經青蒿琥酯或雷帕霉素注射5天后,其血清NO水平與對照水平相當或低于對照(圖6A).與未處理CIAA小鼠相比,無論前處理或后處理都能使SpO2升高,但青蒿琥酯后處理組并未恢復到正常的SpO2水平(圖6B).這些結果表明,青蒿琥酯或雷帕霉素都能通過抑制NO的合成而部分緩解CFA誘導的缺氧現象,但前處理的效果比后處理好.2.7青蒿表現對fpse-la和vegf表達的影響在CFA免疫小鼠中,青蒿琥酯或雷帕霉素前處理3天以及青蒿琥酯后處理5天,均可逆轉HIF-1uf061表達上調,但雷帕霉素后處理5天的效果較差(圖7A).雷帕霉素前處理的HIF-1uf061表達水平與對照相當,而雷帕霉素后處理的HIF-1uf061表達水平為對照的2倍.青蒿琥酯或雷帕霉素處理使血管再生過程受阻,使CFA免疫導致的LA含量增加顯著(圖7B).無論前處理或后處理,青蒿琥酯或雷帕霉素都能促進無氧代謝活動的增強,其中雷帕霉素處理的LA含量比青蒿琥酯處理的LA含量更高,甚至高于CFA處理.以上結果表明,青蒿琥酯或雷帕霉素可抑制CFA誘導的HIF-1uf061和VEGF表達上調,前處理的效果比后處理好.但是,由于血管增生受到抑制,青蒿琥酯或雷帕霉素均不能阻止血清LA水平的升高.2.8青蒿表現在造模前后和聯合給藥前后的質量比較見表1.在造模前給藥組中,經青蒿琥酯處理后,CIAA小鼠的腿部仍有腫脹(圖8A);經雷帕霉素處理后,CIAA小鼠的腿部腫脹減輕(圖8B);青蒿琥酯+雷帕霉素處理的CIAA小鼠表現明顯的足部紅腫現象(圖8C).在造模后給藥組中,青蒿琥酯處理的CIAA小鼠的關節(jié)及腳趾可見明顯紅腫(圖8D),但雷帕霉素或青蒿琥酯+雷帕霉素處理可使紅腫程度大為緩解(圖8E和F).上述結果表明,青蒿琥酯、雷帕霉素對實驗性關節(jié)滑膜炎具有不同程度的預防和治療作用,其中雷帕霉素優(yōu)于青蒿琥酯.在造模前給藥組中,青蒿琥酯與雷帕霉素聯合給藥的效果比單用青蒿琥酯好.造模前聯合給藥效果不如造模后聯合給藥效果的原因可能是前者的雷帕霉素劑量低(30uf06dg/mL),而后者的雷帕霉素劑量高(50uf06dg/mL).2.9滑膜細胞水浸青蒿琥酯前處理的CIAA小鼠,滑膜細胞輕度增生,間質大量中性粒細胞浸潤(圖9A);雷帕霉素前處理的CIAA小鼠,滑膜未見明顯增生,間質見中性粒細胞及淋巴細胞浸潤(圖9B);青蒿琥酯+雷帕霉素前處理的CIAA小鼠,滑膜細胞輕度增生成1~2層,可見散在少許慢性炎細胞浸潤(圖9C).青蒿琥酯后處理的CIAA小鼠,滑膜細胞增生成2層,可見散在慢性炎細胞浸潤(圖9D).雷帕霉素后處理的CIAA小鼠,滑膜細胞增生成2層,未見明顯炎細胞浸潤(圖9E);青蒿琥酯+雷帕霉素后處理的CIAA小鼠,滑膜細胞未見明顯增生,未見炎細胞浸潤(9F).由上述結果可知,無論前處理或后處理,雷帕霉素或青蒿琥酯+雷帕霉素的效果均優(yōu)于青蒿琥酯,其中青蒿琥酯+雷帕霉素后處理對于阻斷滑膜增生及炎性浸潤具有良好作用,可能是實驗性RA模型治療的較好方案之一.3no的作用意義基于TNFuf061單抗的生物療法已獲準用于臨床治療RA患者,在一定程度上解除了RA患者的病痛.可是,仍有多達40%的患者對于TNFuf061單抗治療無應答或不敏感,凸顯出開發(fā)其他替代性治療藥物的緊迫性和必要性.為什么RA患者中存在TNFuf061單抗的無應答者呢?根據本文得出的結論,NO爆發(fā)性缺氧是啟動關節(jié)滑膜血管新生和細胞增殖并導致滑膜炎乃至關節(jié)炎的關鍵因素,但NO既可由TNFuf061激發(fā),也能由IL-1uf062等其他促炎癥細胞因子激發(fā).因此,僅僅抑制TNFuf061而不抑制其他促炎癥細胞因子就不足以阻斷炎癥誘導的NO合成,這可能是TNFuf061單抗僅對部分RA患者有效的原因.由此推論,用工程肽或反義技術封閉TNF受體對保護RA患者免受關節(jié)炎癥損傷的作用可能也是有限的.構建基于發(fā)病機理的RA動物模型不僅有利于篩選和評價抗RA候選藥物,而且可以從另一個側面揭示RA的真正病因.在小鼠中進行CIA造模需要含有加熱滅活細菌的CFA對CⅡ誘導的免疫激活作用加以強化,而且造模所需要的時間較長(3~4周).我們嘗試將CⅡ-CFA免疫由皮內注射改成關節(jié)內注射后,已將造模至滑膜炎出現的時間縮短到3天.由于已有報道稱抗CⅡ反應只是RA致病的結果而非原因,因此我們嘗試用CFA替代CⅡ-CFA進行造模,結果可在1~3天內誘導急性滑膜炎.這可能是迄今為止已知最快捷的小鼠RA造模方法之一,有望成為抗早期RA藥物高通量篩選及高效藥理評價的實驗平臺.關于NO在RA發(fā)作中的意義,Perkins等人報道,誘導型NO合酶(iNOS)基因敲除可賦予小鼠對骨骼消融的抗性,表明NO控制著RA發(fā)病的某個關鍵環(huán)節(jié).最近,Chow等人報道,廣泛用于骨關節(jié)炎治療的透明質酸可通過抑制滑膜中iNOS活性阻斷佐劑誘導關節(jié)炎大鼠的軟骨及骨骼侵蝕性損傷.盡管過去曾有人提及NO在RA致病過程中的可能作用,但只注意到NO誘導免疫功能失調或NO調節(jié)線粒體活性.作為RA病因的機理性探索,我們最近首次證實了病原體感染、促炎癥細胞因子上調、NO爆發(fā)、缺氧誘導、血管新生、細胞增殖和炎性浸潤之間的因果關系.Ng等人在RA患者中發(fā)現,氧分壓(tPO2)與滑膜炎癥之間存在著直接的相關性,認為缺氧是關節(jié)發(fā)生炎癥的一個可能的驅動因素.同樣,本研究所觀察到的免疫激發(fā)性NO與SpO2的互作也支持這一結論.那么,NO究竟是如何驅動缺氧的呢?Han等人指出,NO可通過加速進入紅細胞促進其自身消耗,NO可能占據血紅蛋白中的O2結合位點.滑膜原本就是一個相對缺氧的組織,其軟骨中的氧分壓從表層的6%到深層的1%,NO的大量積累將使滑膜的缺氧狀況更趨嚴重.同時,NO也可跨膜進入線粒體內并結合細胞色素c氧