甘藍(lán)型油菜‘秦油8號(hào)’對(duì)不同水平pb的耐性及富集效應(yīng)

植物提取是利用植物將土壤中的重金屬吸收并轉(zhuǎn)移到植物的可收獲部分，減少土壤中的重金屬含量。這是目前研究最廣泛、最具前景的植物修復(fù)技術(shù)。目前,全世界大約發(fā)現(xiàn)了400多種超富集植物,我國(guó)陸續(xù)報(bào)道的超富集植物有蜈蚣草(富集As),東南景天(富集Zn),商陸(富集Mn)、龍葵(富集Cd),海州香薷(富集Cu),寶山堇菜(富集Cd)等。但是大多數(shù)超富集植物植株矮小,生物量低,生長(zhǎng)緩慢,且大多沒有經(jīng)濟(jì)效益,限制了植物修復(fù)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。因此,研究生物量高、對(duì)重金屬吸收能力強(qiáng)、不存在新的生態(tài)問題且有經(jīng)濟(jì)效益的植物(如油菜、玉米、向日葵、豌豆、燕麥、大麥、蕎麥、印度芥菜和白菜等)及其強(qiáng)化吸收條件,促進(jìn)土壤中重金屬的溶解并向地上部的運(yùn)輸,從而大大提高修復(fù)效率已經(jīng)成為當(dāng)前該領(lǐng)域研究的新特點(diǎn)。油菜是我國(guó)主要農(nóng)作物之一,有資料表明某些油菜具有修復(fù)鉛鎘污染土壤的能力,且在污染條件下具有高生物量。但目前對(duì)油菜的研究多集中在芥菜型油菜上,對(duì)甘藍(lán)型油菜的Pb富集效果以及Pb在油菜籽實(shí)中的積累報(bào)道較少。本試驗(yàn)以關(guān)中地區(qū)普遍種植的甘藍(lán)型油菜‘秦油8號(hào)’品種為供試材料,采用盆栽試驗(yàn)研究了土壤不同濃度梯度重金屬Pb污染下油菜的生長(zhǎng)和累積效應(yīng),并對(duì)螯合劑輔助下油菜的修復(fù)效果進(jìn)行了初步探討,以期為受Pb污染土壤的植物修復(fù)提供理論參考。1材料和方法1.1試驗(yàn)作物和種子實(shí)驗(yàn)土樣采自陜西省楊凌示范區(qū)南莊村農(nóng)田0～20cm的表層土,土壤類型為土。土樣經(jīng)自然風(fēng)干后混合均勻,過4mm篩,室溫保存?zhèn)溆?。土壤基本理化性質(zhì)為:pH7.9(水土比為2.5∶1),陽離子交換量161.8mmol·kg-1,有機(jī)質(zhì)35.7g·kg-1,堿解氮58.2mg·kg-1,有效磷575.98mg·kg-1,速效鉀1.11g·kg-1,全Pb含量30.43mg·kg-1。供試作物為甘藍(lán)型油菜品種‘秦油8號(hào)’,其種子購(gòu)自楊凌示范區(qū)金道種業(yè)有限公司。實(shí)驗(yàn)所用螯合劑為:EDTA+乙酸(c/c=2∶1,pH4.1)。1.2土壤pb添加量的選擇采用直徑36.5cm、高26cm帶有托盤的塑料盆進(jìn)行土培實(shí)驗(yàn),每盆盛過篩風(fēng)干土7.5kg,按照盆栽植物對(duì)養(yǎng)分的需求比例,分別加入尿素、磷酸二氫鉀和硫酸鉀2000、400和400mg·kg-1作為底肥,并充分混勻。以分析純Pb(NO3)2作為Pb污染試劑,用去離子水配成母液,再逐級(jí)稀釋配成溶液,分別按照Pb添加量為0、300、500、1000、1500和2000mg·kg-1的水平設(shè)計(jì)6個(gè)處理,分別噴灑到盆栽實(shí)驗(yàn)的土壤中,邊噴邊攪拌,以保證Pb的均勻分布,保持土壤濕度為田間持水量的60%～70%,并在溫室中穩(wěn)定3個(gè)星期,每處理重復(fù)3次。2008年3月20日,選擇生長(zhǎng)健壯,長(zhǎng)勢(shì)和個(gè)體大小一致的油菜幼苗分別移栽至盆中,每盆6株。植物在自然光照下生長(zhǎng),定期以稱重法加自來水(pH6.8,水中未檢出Pb2+)澆灌,保持土壤濕度為田間持水量的60%～70%。幼苗移栽生長(zhǎng)40d后測(cè)定株高,并采集葉片測(cè)定葉綠素、游離脯氨酸含量;移栽50d后選擇土壤Pb添加量1000mg·kg-1的處理,添加螯合劑(共設(shè)2、6、10和15mmol·kg-14個(gè)水平)進(jìn)行螯合強(qiáng)化實(shí)驗(yàn);加入螯合劑10d后收獲所有植株,用蒸餾水洗凈整個(gè)植株,晾干,再將地上部和地下部分開,在105℃下殺青0.5h,70℃烘干至恒重,用電子天平稱取各部分干重。烘干樣品粉碎過40目篩,用于測(cè)定重金屬Pb含量。1.3測(cè)量和分析的設(shè)計(jì)和方法1.3.1陽離子交換量采用常規(guī)分析方法測(cè)定。其中pH采用電位法(水土比為2.5∶1);陽離子交換量(CEC)采用醋酸銨(pH7.0)交換法;堿解氮含量采用半微量凱氏法;有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量(外加熱)法;有效磷采用NaHCO3浸提法;速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度法測(cè)定。1.3.2葉綠素含量的測(cè)定用直尺測(cè)定株高;烘干稱重法測(cè)定植物莖葉和根的干重;葉綠素含量用80%丙酮提取,用分光光度法測(cè)定;游離脯氨酸采用氨基水楊酸-酸性茚三酮比色法測(cè)定。1.3.3微波消解和測(cè)定pb含量稱取粉碎后的植物樣品0.2g,放入聚四氟乙烯消解罐中,加入1mL蒸餾水將樣品潤(rùn)濕,再加入體積比為5∶1的HNO3和HClO4混合液6mL,用新儀MDS-6型微波消解儀消解(消解條件見表1),消解后的樣品經(jīng)加熱趕酸后,轉(zhuǎn)移到25mL容量瓶,用蒸餾水定容,最后用日立Z-5000型原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定其中的Pb含量。測(cè)定條件為波長(zhǎng)283.3nm,狹縫寬1.3nm,燈電流9.0mA,空氣流量15.0L·min-1,燃?xì)饬髁?.2L·min-1,測(cè)量器高度7.5mm。1.4處理數(shù)據(jù)所獲數(shù)據(jù)用SPSS13.0和MicrosoftExcel軟件進(jìn)行分析,并檢測(cè)相關(guān)性及差異顯著性。2結(jié)果與分析2.1pb對(duì)紫菜生長(zhǎng)指標(biāo)的影響土壤添加外源Pb在一定程度上影響了油菜的生長(zhǎng)。其中,當(dāng)土壤Pb添加水平大于1000mg·kg-1時(shí),油菜逐漸出現(xiàn)了植株矮小、葉片失綠、脫落等癥狀,但并沒有死亡。所加的重金屬Pb量不同,油菜的株高、地上部和根部干重都有所不同。表2為各水平Pb處理下油菜的生物量指標(biāo)的平均值及其差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果。從表2可以看出,各水平Pb處理油菜的株高和干重表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì),而且其間存在顯著性差異。其中,在低水平Pb處理(300和500mg·kg-1)下,油菜的株高、地上部和根部干重比相應(yīng)對(duì)照略有增加但差異不顯著(P>0.05),當(dāng)Pb添加量為500mg·kg-1時(shí)分別比相應(yīng)對(duì)照增加了6.5%、4.3%和13.8%。結(jié)果顯示低水平的Pb對(duì)油菜的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,這可能是鉛的加入促使其他必需營(yíng)養(yǎng)元素的離子更為有效所致;當(dāng)Pb的添加量大于1000mg·kg-1時(shí),油菜株高、地上部和根部干重開始隨著土壤Pb含量的增加而逐漸降低,其中在2000mg·kg-1Pb處理下,各部分生長(zhǎng)指標(biāo)分別比相應(yīng)對(duì)照顯著降低8.02%、21.19%和19.77%,此時(shí)Pb對(duì)油菜的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著抑制作用,而且地上部干重反應(yīng)最敏感。2.2不同濃度pb脅迫對(duì)油茶葉片葉綠素a含量的影響葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì),其含量的多少直接標(biāo)志著生長(zhǎng)能力的強(qiáng)弱。脯氨酸是植物細(xì)胞內(nèi)最重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一,在正常環(huán)境下生長(zhǎng)的植物體內(nèi)脯氨酸含量較低,但在干旱、高鹽、高溫、冰凍、紫外線以及重金屬等脅迫條件下,脯氨酸的含量可增加10～100倍。因此可將二者作為油菜對(duì)重金屬Pb污染的耐性指標(biāo)。從表3可以看出,低水平(300～500mg·kg-1)Pb處理時(shí),油菜葉片葉綠素a含量較對(duì)照有所增加但未達(dá)到顯著水平(P>0.05);當(dāng)Pb的添加量超過1000mg·kg-1時(shí),葉綠素a含量開始出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì),且隨著Pb處理水平的升高,其下降幅度更大,1500和2000mg·kg-1處理分別比對(duì)照顯著降低30.91%和55.45%。這表明高濃度的Pb脅迫對(duì)油菜葉片葉綠素造成嚴(yán)重的破壞,干擾了葉綠素的生物合成,影響了葉片光合能力。從表3還可以看出,各濃度Pb脅迫下油菜葉片葉綠素b含量和葉綠素總量與葉綠素a含量的變化趨勢(shì)基本一致,但Pb對(duì)葉綠素a的影響比葉綠素b更明顯。從表3可以看出,油菜體內(nèi)脯氨酸含量隨著土壤Pb處理濃度的升高而增加,且各處理間及其與對(duì)照間均存在顯著差異(P<0.05);脯氨酸含量與重金屬濃度呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.9908**)。當(dāng)Pb添加量為2000mg·kg-1時(shí),油菜體內(nèi)脯氨酸含量比對(duì)照升高了將近18倍,這也證實(shí)油菜體內(nèi)存在對(duì)重金屬Pb脅迫的耐性機(jī)制。脯氨酸在葉片中的積累一定程度上緩解了質(zhì)膜損傷對(duì)植物造成的危害,這有利于維持植物體內(nèi)的代謝平衡,保持植物的正常生長(zhǎng)。2.3土壤重金屬pb含量的影響由表4可以看出,油菜體內(nèi)的Pb累積量隨土壤Pb添加量的增加而呈上升趨勢(shì),但根部含Pb量增加幅度明顯大于地上部和籽實(shí),加Pb處理的地上部、籽實(shí)和根部Pb含量分別是相應(yīng)對(duì)照的1.57～5.35倍、5.97～9.20倍、1.81～14.31倍。可見,重金屬Pb主要積累在油菜根部,向莖葉和籽實(shí)遷移累積的量相對(duì)較少,從而使富集系數(shù)隨之降低。另外,油菜籽實(shí)含Pb量明顯小于地上部和根部,這說明重金屬Pb對(duì)油菜籽實(shí)的污染最小。表4顯示,油菜地上部和籽實(shí)Pb含量以及每盆油菜對(duì)Pb的吸收總量呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì),即隨土壤加Pb量的增加先逐漸遞增,于加Pb量為1500mg·kg-1時(shí)油菜累積Pb總量三者均達(dá)到最大值,之后累積Pb量反而有所下降,但所有加Pb處理均顯著高于相應(yīng)對(duì)照(P<0.05)。這可能由于隨土壤Pb含量增加,其毒性也不斷增強(qiáng),對(duì)植物的機(jī)能造成損害也逐漸加重,從而抑制了油菜植株對(duì)土壤Pb的吸收及向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。與地上部Pb含量變化有所不同,在本實(shí)驗(yàn)土壤所添加的Pb濃度范圍內(nèi),根系含鉛量隨土壤加鉛量的增加呈逐漸遞增趨勢(shì),二者呈顯著的正相關(guān)性(r=0.9799**),在土壤添加Pb濃度達(dá)到2000mg·kg-1時(shí),油菜根部Pb含量也達(dá)到最大值192.26mg·kg-1。2.4螯合劑對(duì)油菜地上、底部重金屬含量的影響本實(shí)驗(yàn)所用的螯合劑為EDTA與乙酸的混合試劑,其摩爾比為2∶1。其中EDTA是最常見的一種螯合劑,對(duì)很多重金屬都有很好的螯合作用。EDTA與乙酸混合,一方面可以降低土壤的pH,有利于植物對(duì)Pb的吸收;另一方面,乙酸具有解毒作用,可降低重金屬離子對(duì)土壤微生物和植物的毒性。由圖1可知,在4種水平螯合劑處理下的油菜地上部和根部重金屬含量均極顯著大于相應(yīng)對(duì)照(0mmol·kg-1),而地上部的Pb量又明顯高于同濃度的根部含量。其中,2～15mmol·kg-1螯合劑處理的地上部含Pb量分別比對(duì)照增加了4.2、6.1、11.6、18.5倍,而根部的重金屬含量增加遠(yuǎn)沒有地上部明顯。這說明螯合劑的施用有效地活化了土壤中的Pb,增強(qiáng)了Pb的生物可利用性,使其移動(dòng)性大大增加。本實(shí)驗(yàn)中還觀察到,當(dāng)加入不同水平螯合劑以后,油菜地上部Pb含量迅速上升,但是與未加螯合劑的對(duì)照相比,植株生長(zhǎng)狀況基本一致,除了少許葉片發(fā)黃外并未出現(xiàn)明顯傷害,直到高濃度(15mmol·kg-1)螯合劑處理下,油菜才出現(xiàn)干枯、死亡等重金屬中毒癥狀。這進(jìn)一步證明,重金屬Pb經(jīng)過一定程度的螯合可能會(huì)降低它的生物毒性。因此本實(shí)驗(yàn)中對(duì)于Pb添加水平為1000mg·kg-1的污染土壤,當(dāng)螯合劑添加量為10mmol·kg-1時(shí),油菜具有最高的Pb提取效果。3最大限度消除pb對(duì)種子生長(zhǎng)的影響,主要表現(xiàn)為(1)有關(guān)重金屬植物修復(fù)方面的研究,國(guó)內(nèi)外已經(jīng)取得了重要進(jìn)展,但有些問題仍待解決。本實(shí)驗(yàn)利用甘藍(lán)型油菜‘秦油8號(hào)’對(duì)堿性土壤重金屬Pb的修復(fù)效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,甘藍(lán)型油菜‘秦油8號(hào)’對(duì)土壤Pb污染具有一定的耐性,低濃度的Pb處理對(duì)油菜的生長(zhǎng)表現(xiàn)促進(jìn)作用,高濃度Pb處理抑制油菜生長(zhǎng),這與前人的研究結(jié)果相似。同時(shí),重金屬Pb可以引起油菜的抗性反應(yīng),表現(xiàn)在油菜體內(nèi)的游離脯氨酸含量隨Pb濃度的升高而上升,二者之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性。但這種耐性是有一定限度的,高于這個(gè)限度則會(huì)受到傷害,從而表現(xiàn)出植株矮化、葉片失綠等癥狀。實(shí)驗(yàn)證明,1000mg·kg-1可能是油菜‘秦油8號(hào)’受Pb毒害的臨界濃度。(2)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Pb在油菜體內(nèi)的累積量分布大小為:根部>地上部>籽實(shí),其含量也隨著土壤重金屬Pb濃度的增加而提高,但這種增加是有限度的,超過限度就會(huì)對(duì)油菜造成傷害,使生物量下降,從而使Pb吸收總量降低。本實(shí)驗(yàn)首次研究了Pb在油菜籽實(shí)中的分布特性,雖然與油菜其他器官相比油菜籽實(shí)積累Pb含量很少,但其含量仍高于國(guó)家《植物油料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB19641-2005)規(guī)定的≤0.2mg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)限值,因此建議油菜整體采收、晾曬后,進(jìn)行籽實(shí)的分離,將籽實(shí)用于工業(yè)用油(如生物柴油)的生產(chǎn),秸稈可作為優(yōu)質(zhì)薪柴、發(fā)電或集中供熱的氣化燃料,最后對(duì)焚燒灰分進(jìn)行安全填埋處理。這樣既能對(duì)污染土壤進(jìn)行修復(fù),還能夠取得一定經(jīng)濟(jì)效益,降低其工程的投入成本。(3)‘秦油8號(hào)’對(duì)Pb的修復(fù)效率雖然與超富集植物相比有較