蛋白質組研究進展

人類科學研究的完成表明，科學生活進入了后基因組時代。蛋白質組學的研究被提升到了前所未有的高度。蛋白質組學是隨著研究技術的不斷完善而發(fā)展的。O’Farrel等于1975年建立了雙向電泳技術(twodimensionalelectrophoresis,2-DE),可同時分離數(shù)千種蛋白質。20世紀80年代,pH梯度膠條代替了載體兩性電解質,改善了雙向電泳的重復性和加樣量;80年代后期研發(fā)的電噴霧電離質譜(ESI-MS)和基質輔助激光解吸電離質譜(MALDI-MS),可以精確測定生物大分子的相對分子質量及多肽序列,使得微量快速的蛋白質測定得以實現(xiàn);生物信息學的建立使得分析復雜的蛋白質圖譜變得更容易。雙向電泳、質譜和生物信息學技術被稱為蛋白質組研究的三大核心技術。除此以外,新的蛋白質組研究技術也不斷出現(xiàn),如用于定量蛋白質組學研究的同位素標記親和標簽技術和雙色熒光技術;用于蛋白質—蛋白質相互作用研究的酵母雙雜交技術、蛋白質復合物免疫分離與質譜鑒定技術;用于大規(guī)模蛋白質分離與鑒定的多維色譜—質譜聯(lián)用技術;用于翻譯后修飾的蛋白質圖譜展示與檢測技術及蛋白質芯片技術。本文對近些年蛋白質組研究中涌現(xiàn)出的一些新技術做一概述。1水平質譜差異表達傳統(tǒng)的雙向電泳—質譜分析方法在定量方面的準確度、可靠性和重復性尚不盡如人意。Gygi等發(fā)展了一種小分子量試劑,即同位素編碼的親和標簽(isotope-codedaffinitytag,ICAT)。ICAT試劑分為D0和D8兩種,相差8個質量單位,均包括3個部分:與巰基反應的基團、可與同位素連接的部位及與生物素結合的基團。用D0和D8試劑分別與不同的蛋白質樣品反應,試劑選擇性與半胱氨酸反應,然后把兩種反應產(chǎn)物混合,酶解,用親和色譜等色譜手段分離被標記的肽段,進行LC/MS/MS或MALDI-TOF測定。若一對峰相差8個質量數(shù),則為同一種蛋白質。由D0和D8峰的相對強度可得到此蛋白質在兩種樣品中的相對豐度(圖1)。這是一種全景式蛋白質差異表達分析新技術,可有效分析2-DE不易檢測的膜蛋白和低豐度蛋白質,是蛋白質研究又一里程碑,其優(yōu)點及意義在于:(1)混合樣品(來自正常和病變細胞或組織等)可直接測試。(2)快速定性和定量鑒定低豐度蛋白、疏水性蛋白等。(3)結合液相色譜和串聯(lián)質譜技術,使高通量,自動化蛋白質組分析更簡單、準確和快速。(4)快速找出重要功能蛋白質(與疾病相關蛋白質等)及生物標志分子,進而用于疾病快速診斷。但ICAT的分子量約為500Da,對一些小肽段來說是一個很大的修飾物,會增加數(shù)據(jù)庫搜索算法的復雜性;無法分析不含Cys的蛋白質。但這一不足可以通過合成對其他蛋白質基團專一的ICAT試劑來彌補,這一思想會有力的推動對蛋白質翻譯后修飾的研究。最近,人們根據(jù)不同的實驗目的衍生出其它一些ICAT技術和試劑,如:Michael等在ICAT試劑基礎上發(fā)明了磷酸化蛋白同位素親和標簽試劑(phosphoproteinisotope-codedaffinitytags,PhIAT),為研究和鑒定磷酸化蛋白的磷酸化位點提供了一條新途徑;HuilinZhou等將傳統(tǒng)的ICAT技術進行改進,提出了固相同位素標簽(solidphaseisotopetaggingreagent)技術。2雜交活性質粒技術的應用酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質間相互作用的有力工具。其基本原理是:真核生物轉錄激活因子都由兩部分獨立的功能域組成,即DNA結合功能域(DNA-BD)和激活功能域(AD)。DNA-BD的作用是與特異的啟動子結合,AD的作用是引導RNA聚合酶Ⅱ復合物,兩者靠近并協(xié)同作用,才能使下游的基因得以轉錄。若將待測蛋白之一與DNA-BD融合,蛋白之二與AD融合,若待測的兩種蛋白有相互作用,則DNA-BD和AD靠近并激活報道基因的轉錄,借此可研究蛋白質間的相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)同以往研究蛋白質相互作用的手段相比,具有以下優(yōu)點:(1)檢測蛋白質之間相互作用在細胞內進行,不需要額外的純化步驟;(2)所證實的蛋白質間的相互作用更接近體內的真實水平;(3)可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。此技術也有一些局限性,人們相應地做了一些改進,主要有:(1)分析蛋白質間相互作用定位于細胞核內,而許多蛋白質間相互作用在核內無法進行。另外有些蛋白質的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白質的輔助,這限制了某些胞外蛋白質和細胞膜受體蛋白質等的研究。為此初步建立了哺乳動物雙雜交系統(tǒng)作為酵母雙雜交系統(tǒng)的輔助手段。另外還構建了SOS恢復系統(tǒng)和泛素專一性蛋白酶系統(tǒng),針對膜受體、細胞外分泌蛋白質等進行研究。(2)為了解決“假陽性”的問題,Marsolier等人提出了建立在RNA聚合酶Ⅲ轉錄基礎上的雙雜交系統(tǒng)。James等人還構建了含三種不同的報告基因(ADE2,HIS3和LacZ)的酵母PJ69-4A菌株,可靈敏地檢測出很弱的結合作用,顯著消除假陽性。近年來,在原有的酵母雙雜交的基礎上又發(fā)展了反向雙雜交體系(reversetwo-hybridsystem)和三雜交體系(three-hybridsystem)。1996年Vidal等建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng),提供了簡便的鑒定阻斷蛋白間相互作用的方法。它能發(fā)現(xiàn)可導致相互作用的蛋白質間發(fā)生解離的小分子物質。許多疾病與蛋白質異常的相互作用有關,這對于疾病的治療非常有意義。三雜交系統(tǒng)主要用于研究多蛋白質復合體之間的相互作用。在單個酵母細胞中,傳統(tǒng)的雙雜交體系只能研究兩個蛋白質之間的相互作用,易造成假陽性或假陰性。而在三雜交體系中,加入受表達調控的第三種蛋白質能使蛋白質復合體的相互作用更符合生理狀態(tài)。三雜交體系是對雙雜交體系的一個有益補充。以此為基礎甚至可再構建四雜交體系和反向三雜交體系,以研究更廣泛的蛋白質間相互作用。由于雙雜交系統(tǒng)并不能解決所有的蛋白質相互作用問題。因此,在對其進一步改進的同時,其他研究蛋白質相互作用的手段也是必不可少的。3細胞裂解液的純化串聯(lián)親和純化是一項新的純化蛋白質混合物的技術。此方法的巧妙之處在于設計了一個雙重分子標簽,由金黃色葡萄球菌蛋白質A的兩個IgG結合結構域(ProtA)及一個鈣調蛋白結合多肽(CBP)組成,結構域與多肽間由一個TEV蛋白酶切位點隔開(圖2)。操作時,將靶蛋白與TAP標簽融合于合適的表達質粒,并將構建好的質粒導入相應的細胞或生物體表達,若融合蛋白能以天然水平或接近天然水平表達,則可形成穩(wěn)定的復合物。溫和裂解細胞得到的細胞裂解液在非變性條件下與IgG基質一起溫育,復合物中的靶蛋白可通過ProtA標簽和IgG特異結合,洗脫掉雜蛋白后,用TEV蛋白酶切割標簽,洗脫下仍帶有CPB標簽的復合物,這是第一步純化。在鈣離子存在的條件下,將第一步純化后的產(chǎn)物與鈣調蛋白包被的珠子一起溫育,復合物通過CBP標簽又一次結合于珠子上,然后洗棄雜蛋白及殘余的TEV蛋白酶,溫和條件下用EGTA洗脫,就可以得到高純度的天然構象的靶蛋白(圖3)。洗脫好的蛋白可用EDMAN降解法或Western印記處理,經(jīng)指數(shù)梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后即可用于質譜分析。TAP技術在低濃度情況下,也能高效富集目的蛋白,且純化多在溫和天然條件下進行。與酵母雙雜交技術相比其優(yōu)勢在于可用于分析反應中蛋白間的瞬時相互作用;鑒定與靶蛋白發(fā)生直接或間接作用的配體。目前,此技術已在酵母蛋白質組研究中廣泛應用。此技術也有局限性:少數(shù)靶蛋白會在TEV蛋白酶處理后被破壞;細胞裂解時有時會破壞TAP標簽;細胞內源鈣調蛋白會與CBP結合,影響第二次純化等。為此,人們主要從標簽系統(tǒng)和純化方法上改進TAP技術。在對標簽系統(tǒng)的改進中Puig等發(fā)展了N末端標簽,差減式標簽和分離式標簽。在純化方法的改進中可采用省略透析,加入非離子去垢劑,提高鹽濃度等手段,以提高表達蛋白濃度。準備細胞抽提物時,為了排除降解的可能性,可采用Western印記技術檢測融合蛋白的ProtA部分,從而確定抽提效果及TAP標簽的穩(wěn)定性。4-de-ms/ms結合的多維色譜技術近年來,液相色譜(LC)和毛細管電泳(CE)的發(fā)展為蛋白質和多肽的分離分析提供了新的手段。然而一維分離模式所能提供的分辨率和峰容量十分有限。多維色譜包括體積排阻色譜(SEC)、離子交換色譜(IEC)、親和色譜(AC)和反相液相色譜(RPLC)等,可以采用多種不同的液相分離模式之間或液相分離模式與CE之間以及不同CE模式之間偶聯(lián),從而實現(xiàn)對復雜樣品的分離。多維色譜—質譜聯(lián)用技術可以彌補2-DE分離能力有限,重復性較差,操作程序較復雜,而且難以自動化的不足。目前,常用的二維LC有離子交換色譜—體積排阻色譜(2D-IEC-SEC)、離子交換色譜—反相液相色譜(2D-IEC-RPLC)和親和色譜-反相液相色譜(2D-AC-RPLC)等。2D-IEC-SEC與質譜聯(lián)用技術中,樣品在第一維根據(jù)各組分離子交換性能的不同而分離,在第二維中依據(jù)分子量的不同進一步分離,并通過MS/MS對多肽進行序列分析,最后在計算機上利用數(shù)學算法對所獲得的序列與從基因組翻譯的蛋白質序列進行比較,確定出多肽所對應的蛋白質。2D-IEC-RPLC與質譜聯(lián)用是根據(jù)電荷和疏水性差異,對樣品進行離子交換色譜分離后,再進行反相液相色譜分離。Yates研究組在此基礎上加以改進:將IEC和RPLC的色譜柱以串聯(lián)分離的方式合并于同一色譜柱中。該方法被稱為多維蛋白質鑒定技術(multidimensionalproteinidentificationtechnology,MudPIT),可對樣品量較少的蛋白質進行快速分析,適用于蛋白質組學中大規(guī)模蛋白質的分離鑒定。Yates研究組利用這一技術分析啤酒酵母的酶解產(chǎn)物,鑒定出1484個蛋白,其中包括許多低豐度蛋白和跨膜蛋白。2D-AC-RPLC與質譜聯(lián)用技術是用親和色譜柱對某一類具有特異性親和力的蛋白質進行提取,然后進行LC-MS或MS/MS鑒定,確定出蛋白質的種類和修飾位點。此方法對研究翻譯后蛋白質修飾,特別是磷酸化蛋白質組的研究具有重要意義。另外,親和色譜與質譜聯(lián)用可以分析蛋白質復合物,同時對蛋白質相互作用網(wǎng)絡進行研究。除了上述的二維液相色譜分離系統(tǒng),多維色譜分離模式還包括LC與CE合理的組合并與各種質譜在線聯(lián)用,以及二維毛細管電泳分離模式。這些技術都是多維色譜研究的重要內容。LC與CE具有理想的互補性,而且分離速度快。因此,LC與EC聯(lián)用可實現(xiàn)各種復雜樣品,特別是生物樣品中不同性質組分的高效、高分辨率和快速分離。多維色譜—質譜技術尚處于探索階段,目前無法完全代替2-DE,但可彌補2-DE-MS的一些缺陷。它是分離分析復雜體系很有前景的技術手段。5seldi法檢測蛋白質蛋白質芯片是一種固相支持物表面預先固定大量的探針蛋白,形成高密度排列的探針蛋白點陣。將帶有特殊標記(如熒光染料標記)的樣品蛋白質與芯片上的探針雜交,探針與待測蛋白結合,然后通過檢測器檢測標記物并用分析軟件處理所得結果。最近,美國Ciphergen公司推出了一種基于蛋白質芯片和質譜技術的分析平臺——表面加強激光解吸電離—飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)蛋白質芯片技術。它將蛋白質芯片與質譜技術結合在一起。其核心是一系列具有多種特性的蛋白質芯片。將蛋白質混合物與一系列不同特性的ProtenChip結合,洗去不與芯片結合的蛋白,將得到的復合物與能量吸收分子結合成混合晶體,利用激光脈沖輻射使混合晶體解析成不同質荷比的離子,根據(jù)它們在儀器場中飛行時間的長短不一繪制出質譜圖,這樣就得到了基于不同相互作用的多維蛋白質圖譜。此方法可獲得可重復的、統(tǒng)一的質譜圖,因而可用于定量蛋白質研究。根據(jù)SELDI芯片表面的不同成分,可將其分為化學表面芯片和生物表面芯片。此外,新近還開發(fā)了一種表面預活化的芯片(pre-activatedsurface,PS),可根據(jù)實驗需要偶聯(lián)相應的分子如蛋白質和小分子化合物等。蛋白質芯片技術在蛋白質組學研究中有很多優(yōu)勢:①SELDI系統(tǒng)集分離、純化、檢測和分析為一體,具有快速、簡便、高通量的特點;②可直接采用血液、尿、細胞裂解液等粗生物樣品進行分析而無需預先處理;③可檢測出<1fmol的蛋白質,因此每次分析只需要0.5~5μl或2000個細胞的超微量樣本?？蓹z測出一些通常難以鑒定的低豐度、小分子量蛋白;④鑒定所獲得的信息量大,可直觀顯示樣品中各種蛋白質的相對分子量、含量、等電點、糖基化位點、磷酸化位點等。SELDI蛋白芯片技術在諸多領域得到廣泛的應用,特別是臨床和實驗室蛋白質組學的研究。用之檢測特異性的疾病相關蛋白已經(jīng)在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤及艾滋病、老年性癡呆等疾病中得以證實,對其進一步優(yōu)化有望在將來的臨床實踐中發(fā)展成為一種對早期無癥狀癌癥的新型低創(chuàng)、靈敏特異、高通量、大規(guī)模的疾病篩查方法。另外,此技術還可應用于藥物研發(fā),例如進行藥效學及