蛋白質(zhì)間的相互作用

1rna聚合酶激活轉(zhuǎn)錄相關(guān)功能20世紀(jì)80年代中后期，對真核分離因子進(jìn)行了深入研究，為建立和發(fā)展海南島的雙重混合系統(tǒng)奠定了理論基礎(chǔ)。研究證實(shí),很多真核基因的表達(dá)通常處于較底水平,一旦有轉(zhuǎn)錄激活蛋白的誘導(dǎo)則出現(xiàn)高水平表達(dá),而轉(zhuǎn)錄激活蛋白(如酵母的Gal4)具有能結(jié)合特異性DNA序列和引導(dǎo)RNA聚合酶激活轉(zhuǎn)錄2個功能。進(jìn)一步的研究表明,這2個功能分別由2個獨(dú)立的功能區(qū)域負(fù)責(zé),即DNA結(jié)合功能區(qū)(DNA-bindingdomain,DNA-BD)和激活轉(zhuǎn)錄功能區(qū)(ActivationDomain,AD)。前者負(fù)責(zé)結(jié)合上游激活序列(UpstreamActivationSequence,UAS),后者負(fù)責(zé)引導(dǎo)RNA聚合酶復(fù)合體激活基因轉(zhuǎn)錄。DNA-BD和AD對激活轉(zhuǎn)錄是都必不可少的。1985年,Brent和Ptashne將2種不同蛋白的BD與AD重組,仍能產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子,證實(shí)BD和AD在結(jié)構(gòu)上和功能上是可分的。后來,一些研究人員進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)即使AD和BD不在一條多肽上,只要它們在空間上彼此聯(lián)系,即使它們間沒有共價結(jié)合也可激活轉(zhuǎn)錄?；谏鲜鲅芯?Fields和Song于1989年首先創(chuàng)立了酵母雙雜交系統(tǒng)。2ad-y載體的轉(zhuǎn)化酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理是將BD與編碼已知的誘餌蛋白質(zhì)(baitprotein,X)融合,得到BD-X載體,再將未知蛋白質(zhì)(Prey,Y)的基因與AD基因融合,得到AD-Y載體。2個載體共轉(zhuǎn)化至含有報告基因的酵母體內(nèi)表達(dá),由于蛋白質(zhì)X和Y的相互作用從而引起了BD與AD在空間上的接近,激活特異報告基因的表達(dá),使轉(zhuǎn)化體可在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長(圖1)。通過對報告基因表型的檢測,可以定性分析誘餌和靶蛋白間是否有相互作用,并定量地測定相互作用的強(qiáng)弱。3母乳喂養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展和改進(jìn)3.1酵母系統(tǒng)發(fā)育及轉(zhuǎn)化酵母雙雜交系統(tǒng)常用的BD有Gal4和LexA,AD有Gal4、VP16或B42。這些DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域可以相互組合,但每一種組合均有其優(yōu)缺點(diǎn)。比如VP16激活結(jié)構(gòu)域有強(qiáng)激活性,可以用于檢測親和力較低的蛋白之間的相互作用,但與此同時勢必伴隨假陽性比率過高的問題。B42是一個異源的含有88殘基的酸性肽,可以在酵母中激活轉(zhuǎn)錄?；贐42-LexA的酵母雙雜交系統(tǒng)(GALl啟動子)的融合蛋白可以被誘導(dǎo)性表達(dá),以防蛋白相互作用產(chǎn)生了細(xì)胞毒作用而抑制細(xì)胞生長,同時還可以為假陽性提供對照。1)菌株的優(yōu)化:當(dāng)要選擇某個雙雜交系統(tǒng)時,酵母菌株也是要考慮的重要因素。為雙雜交系統(tǒng)而改構(gòu)的酵母菌株包含不同拷貝的上游激活序列。菌株IA0多用于LexA系統(tǒng),該菌株在lacZ報告基因上游包含8拷貝的上游激活序列。而菌株HF7c一般用于基于Gal4的酵母雙雜交分析,在lacZ報告基因的上游只有3拷貝的Gal4上游激活序列。增加相應(yīng)上游激活序列的拷貝數(shù)有助于增加檢測的敏感性,但同時會導(dǎo)致假陽性率增加。2)報告基因的優(yōu)化:目前發(fā)展起來的各種雙雜交系統(tǒng)大多是以Fields等人建立的系統(tǒng)為基礎(chǔ)。這些新系統(tǒng)主要是對報告基因做了一些改進(jìn),最重要的就是引入額外的報告基因,如HIS3基因。經(jīng)過改造帶有HIS3報告基因的酵母細(xì)胞,只有當(dāng)HIS3被啟動表達(dá)才能在缺乏組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上生長。HIS3報道基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是由“誘餌”和“獵物”的相互作用所啟動的。大多數(shù)雙雜交系統(tǒng)往往同時使用2個甚至3個報告基因,其中之一是LacZ。這些改造后的基因在啟動子區(qū)有相同的轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點(diǎn),因此可以被相同的轉(zhuǎn)錄激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。通過這種雙重或多重選擇既提高了檢測靈敏度又減少了假陽性現(xiàn)象。3)轉(zhuǎn)化效率的提高:在雙雜交鑒定過程中要經(jīng)過2次轉(zhuǎn)化,不僅工作量大,且轉(zhuǎn)化效率低,是雙雜交技術(shù)的瓶頸。Bendixen等人通過酵母接合型的引用,避免了2次轉(zhuǎn)化操作,同時又提高了雙雜交的效率。在酵母的有性生殖過程中涉及到2種配合類型:a接合型和α接合型,這2種單倍體之間接合能形成二倍體,但a接合型細(xì)胞之間或α接合型細(xì)胞之間不能接合形成二倍體。根據(jù)酵母有性生殖的這一特點(diǎn),他們將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化α接合型酵母細(xì)胞,“誘餌”表達(dá)載體轉(zhuǎn)化a接合型細(xì)胞。然后分別鋪篩選平板使細(xì)胞長成菌落,再將2種菌苔復(fù)印到同一個三重篩選平板上,原則上只有誘餌和靶蛋白發(fā)生了相互作用的二倍體細(xì)胞才能在此平板上生長。單倍體細(xì)胞和BD融合蛋白與AD融合蛋白不相互作用的二倍體細(xì)胞都被淘汰。長出來的進(jìn)一步通過β-半乳糖苷酶活力進(jìn)行鑒定。這項(xiàng)改進(jìn)不僅簡化了實(shí)驗(yàn)操作,而且也提高了雙雜交的篩選效率。3.2蛋白間相互作用的基因文化和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)酵母雙雜交系統(tǒng)雖然在研究蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮了重要的作用,但仍然存在一定的局限性。傳統(tǒng)雙雜交系統(tǒng)還存在著假陽性高、要求被測蛋白定位于細(xì)胞核,這樣不能研究許多定位在細(xì)胞質(zhì)中或細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì),以及DNA與蛋白質(zhì)之間的直接相互作用等。因此,針對酵母雙雜交系統(tǒng)自身存在的一些不足,以及酵母雙雜交系統(tǒng)在研究的應(yīng)用日益廣泛,酵母雙雜交系統(tǒng)得到了很大的改進(jìn)和發(fā)展,并且衍生出了一些相關(guān)的研究系統(tǒng)?，F(xiàn)在常用的衍生系統(tǒng)有酵母雙雜交的二元誘餌系統(tǒng)、逆向雙雜交系統(tǒng)、非轉(zhuǎn)錄讀出特點(diǎn)的雙雜交系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄激活因子與其相關(guān)蛋白之間的相互作用的雙雜交系統(tǒng)、酵母單雜交系統(tǒng)以及酵母三雜交系統(tǒng)等,這些衍生系統(tǒng)在很大程度上克服了傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性,擴(kuò)大了被研究的蛋白質(zhì)的范圍,提高了系統(tǒng)的靈敏度。1)酵母雙雜交的二元誘餌系統(tǒng):酵母雙雜交的二元誘餌系統(tǒng)(yeasttwo-hybriiddualbaitsystem)是在酵母細(xì)胞中同時引入2個不同的BD(即誘餌)和1個共同的AD(即獵物),如果相關(guān)蛋白質(zhì)間有相互作用,則可激活特異性報告基因的表達(dá),此即二元誘餌系統(tǒng)(圖2)。該系統(tǒng)可以在一次雜交中同時進(jìn)行2個獨(dú)立的篩選并比較其結(jié)合能力的差異,有效的提高了篩選效率,可以進(jìn)行靶蛋白突變位點(diǎn)的研究,也可方便地比較靶蛋白與同一蛋白家族中不同成員之間相互作用的特異性。2)逆向雙雜交系統(tǒng):傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)是對蛋白質(zhì)之間的相互作用的正向選擇,而逆向雙雜交系統(tǒng)(reversetwo-hybridsystem)是采取逆向篩選的方法,該系統(tǒng)最大的特點(diǎn)在于將蛋白質(zhì)之間的解離作用變?yōu)橐环N選擇優(yōu)勢。其原理是當(dāng)“誘餌”與“獵物”之間發(fā)生相互作用時,可引起毒性報告基因的表達(dá),該報告基因的產(chǎn)物對酵母細(xì)胞是有毒性或是致死的,細(xì)胞不能存活;但是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生點(diǎn)突變或由于小分子化合物、多肽的加入而使蛋白質(zhì)之間的相互作用被抑制時,毒性報告基因不能表達(dá),結(jié)果細(xì)胞正常生長(圖3)。通過這個系統(tǒng)可以有效篩選使蛋白質(zhì)發(fā)生位點(diǎn)突變的小分子化合物或多肽,從而在藥學(xué)篩選方面有重大應(yīng)用價值。更重要的是可以用于研究轉(zhuǎn)錄激活因子與其他蛋白的作用,這是傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)難以做到的,因?yàn)檗D(zhuǎn)錄激活因子本身就可使基因表達(dá)而產(chǎn)生假陽性。如使用TUP1蛋白(酵母細(xì)胞中存在的一種通用阻遏蛋白),將其與蛋白X融合,轉(zhuǎn)錄激活因子Y與GAL4蛋白融合,若X與Y相互作用,則抑制毒性基因表達(dá),細(xì)胞正常生長;若X與Y不相互作用,則毒性基因表達(dá)。3)非轉(zhuǎn)錄讀出特點(diǎn)的酵母雙雜交系統(tǒng):傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)只能研究限制在細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)之間的相互作用,而對于定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上諸多的蛋白質(zhì)傳統(tǒng)的方法就無能為力了,因此近年來又建立了一些不直接依賴轉(zhuǎn)錄激活因子的雜交系統(tǒng),即:非轉(zhuǎn)錄讀出特點(diǎn)(non-transcriptionalreadout)的酵母雙雜交系統(tǒng),為解決非細(xì)胞核內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用提供了方案。其代表為SOS招募系統(tǒng)(SOSrecruitmentsystem)和分裂-泛素系統(tǒng)(split-ubiquitinsystem)。SOS招募系統(tǒng)一般采用的酵母菌株是溫度敏感型菌株cdc25Ht41,其編碼Ras鳥苷酸交換因子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF)的基因是突變型的。酵母生長需要有功能的Ras,而Ras的活性依賴于GEF的活性,因此該突變菌株中Ras信號通路是被阻斷的。但是RasGEFHsos如果被募集到酵母質(zhì)膜上,就可以激活酵母的Ras,從而恢復(fù)被阻斷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。該系統(tǒng)的原理是將hSOS與一個被測蛋白Y融合表達(dá),將另一個被測蛋白X與一段能將其定位到細(xì)胞質(zhì)膜的v-Src十四烷基化信號融合表達(dá)。這樣,如果2個被測蛋白之間存在相互作用,hSOS就可以被招募至質(zhì)膜,恢復(fù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,酵母cdc25H就可以在一定溫度下生長;反之,則觀測不到酵母菌落(圖4)。SOS蛋白招募系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)在于被研究蛋白質(zhì)的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核,因此其應(yīng)用范圍更加廣泛。一是可以用來檢測一些不能很好地定位于細(xì)胞核的蛋白之間的相互作用,二是可允許檢測蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)錄后修飾。泛素是一段能與蛋白結(jié)合并介導(dǎo)蛋白降解的短肽,多個泛素分子共價結(jié)合到靶蛋白上形成多聚泛素鏈。泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specificproteases.UBPs)能夠識別并降解靶蛋白,從而釋放泛素。分裂-泛素系統(tǒng)正是建立在UBPs能識別并釋放泛素的特性之上的。在該系統(tǒng)中,蛋白X與泛素C端的一段多肽(Cub)融合表達(dá);蛋白Y與泛素N端一段經(jīng)過修飾的多肽(Nub)融合表達(dá)。修飾使得泛素N端的多肽不能正確折疊,從而使其無法與泛素C端的多肽結(jié)合形成完整的泛素。如果蛋白X與蛋白Y存在相互作用,二者之間的相互作用一方面激活了報告基因的轉(zhuǎn)錄,使得報告蛋白得以表達(dá),繼而,報告蛋白被Cub識別并結(jié)合;另一方面重組了泛素分子(即前述的分裂-泛素),使得UBPs可以識別分裂-泛素并將分裂-泛素與報告蛋白分開(圖5)。被釋放的報告蛋白可以用免疫學(xué)方法檢測到。分裂-泛素系統(tǒng)可以用來檢測核蛋白、胞質(zhì)蛋白以及整合膜蛋白之間的相互作用,成為應(yīng)用最廣泛的酵母雙雜交衍生系統(tǒng)。4)哺乳動物雙雜交系統(tǒng):哺乳動物雙雜交系統(tǒng)(Mammaltwo-hybridsystem)的原理和酵母雙雜交系統(tǒng)相同,把編碼誘餌蛋白和靶蛋白的基因克隆到相應(yīng)的載體上,采用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)入Hela等哺乳動物細(xì)胞中培養(yǎng),當(dāng)二者發(fā)生相互作用時,激活了報告基因,可通過報告基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測,該系統(tǒng)能夠檢測那些相互作用依賴于蛋白翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。5)酵母單雜交系統(tǒng):酵母單雜交系統(tǒng)(YeastOne-hybridSystem)是Li等根據(jù)雙雜交技術(shù)的原理提出的用于研究DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用。其原理是:AD和某個DNA結(jié)合蛋白(DNAbindingprotein,DNAbp)的基因融合于同一質(zhì)粒載體,在報告基因的上游至少有3個串聯(lián)的DNAbp結(jié)合位點(diǎn)(E),DNAbpAD融合蛋白將識別其結(jié)合位點(diǎn)并與之結(jié)合,AD就啟動了下游報告基因的轉(zhuǎn)錄(圖6)。單雜交系統(tǒng)在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及基因調(diào)控等功能研究中有重要作用。6)酵母三雜交系統(tǒng):生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用并不限于兩者之間,而常常涉及到第3個物質(zhì),因此,SenGupt等在雙雜交系統(tǒng)基礎(chǔ)上提出了酵母三雜交系統(tǒng)(YeastThree-hybridSystem)。該系統(tǒng)是研究2個蛋白和第3個成分間的相互作用,第3個成分可以是蛋白質(zhì)、RNA或小分子物質(zhì)。其原理是:誘餌蛋白X和DNABD融合,靶蛋白Y和轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域AD融合,蛋白質(zhì)X和Y由于第3個分子Z的介導(dǎo)從而導(dǎo)致AD和BD在空間上接近,啟動了下游報告基因的表達(dá)(圖7)。4蛋白質(zhì)通過調(diào)式內(nèi)酰胺功能進(jìn)行定位酵母雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)相互作用的研究中起到了重要的作用,在基因篩選、疾病治療等諸多方面也有著廣泛的作用。1)尋找與目的蛋白質(zhì)相互作用的新蛋白質(zhì):酵母雙雜交體系最有力的應(yīng)用是從基因庫中尋找與感興趣蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。通過將目標(biāo)蛋白質(zhì)基因和未知蛋白質(zhì)基因分別連接到BD和AD,分別構(gòu)建融合蛋白,利用酵母雙雜交體系就可以準(zhǔn)確有效的篩選到所需蛋白質(zhì)。2)確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能區(qū)域:酵母雙雜交系統(tǒng)是確定蛋白質(zhì)作用功能區(qū)域的有效辦法。通過對該蛋白質(zhì)進(jìn)行缺失實(shí)驗(yàn),缺失蛋白質(zhì)不同片段以對其中起作用的功能區(qū)域進(jìn)行定位,進(jìn)而在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)改變氨基酸序列,從而找到相互作用發(fā)生所必須的氨基酸殘基。然而這種方法有一定風(fēng)險,因?yàn)榈鞍踪|(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定其高級結(jié)構(gòu),如果缺失掉的片段過大或恰好是其正確折疊所必需的片段,則可能使蛋白質(zhì)無法正確折疊而得到錯誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3)確定多肽類藥物的作用機(jī)理:隨著生物技術(shù)的發(fā)展,多肽類藥物在現(xiàn)代藥學(xué)中所占比重越來越大。酵母雙雜交系統(tǒng)可以確定多肽類藥物與腫瘤、細(xì)菌、病毒來源的蛋白質(zhì)的相互作用位點(diǎn)及其機(jī)理,以揭示多肽類藥物治療的分子機(jī)理以及發(fā)現(xiàn)潛在副作用,為后續(xù)的研究工作及廣泛的臨床應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。4)建立蛋白質(zhì)相互作用圖譜:隨著蛋白質(zhì)組研究計劃的發(fā)展,蛋白質(zhì)在不同組織、不同發(fā)育階段下的相互作用也逐漸成為研究重點(diǎn)。將cDNA庫隨機(jī)與BD、AD連接,表達(dá)蛋白,可以檢測出一系列全新的蛋白質(zhì)之間的相互作用,并可由此繪出不同蛋白質(zhì)聯(lián)系的圖譜。5)確定3個蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)與RNA或小分子的相互作用相比較于酵母雙雜交體系,酵母三雜交體系有更廣泛的應(yīng)用。利