n-甲基-d-天冬氨酸受體與細(xì)胞內(nèi)組織型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶關(guān)系的研究

腦出血是老年人常見(jiàn)的疾病，發(fā)病率、死亡率和致殘率較高。這種疾病的神經(jīng)損傷機(jī)制尚不完全清楚。迄今研究多集中于凝血過(guò)程中產(chǎn)生的凝血酶的神經(jīng)毒性作用,認(rèn)為凝血酶不僅可以引起腦水腫,可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,還能通過(guò)激活蛋白激酶激活受體(PAR)-1改變神經(jīng)細(xì)胞N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的敏感性。凝血酶激活PAR-1可以引起大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)組織型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(tTG)的蛋白表達(dá)和酶活性增高。為了解tTG這一多功能酶是否參與了凝血酶影響NMDA受體敏感性的機(jī)制,我們利用凝血酶作用于原代培養(yǎng)的大鼠小腦顆粒細(xì)胞,tTG抑制劑單丹磺酰尸胺(MDC)干預(yù),對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了研究。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)1.材料與儀器:Wistar大鼠鼠嬰購(gòu)于武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室;細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于美國(guó)Falcon公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;凝血酶、阿糖胞苷和NMDA購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司;TaqDNA聚合酶購(gòu)于中國(guó)華美生物工程公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。使用EPICSALTRAⅡ流式細(xì)胞儀(BECKMANCOULTER公司,美國(guó)),CellQuest軟件獲取數(shù)據(jù),ModifitLT軟件進(jìn)行分析;BH-2顯微鏡(OLYMPUS公司日本);二氧化碳培養(yǎng)箱(SHEL-LAB公司,美國(guó))PCR儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorff公司;凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)GDs7600凝膠掃描分析系統(tǒng)。2.方法:大鼠小腦顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)及分組:出生1d的Wistar大鼠鼠嬰,斷頭處死,解剖顯微鏡下取小腦,細(xì)胞培養(yǎng)至第20天,以神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體做細(xì)胞鑒定,細(xì)胞純度達(dá)到90%可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)細(xì)胞分為3組:(1)空白對(duì)照組:NMDA加入培養(yǎng)液配成3個(gè)工作濃度(0.1×10-4mol/L、0.25×10-4mol/L和0.5×10-4mol/L)處理小腦顆粒細(xì)胞3h;(2)實(shí)驗(yàn)組:0.01U/ml濃度的凝血酶(不引起細(xì)胞凋亡的低濃度)預(yù)處理小腦顆粒細(xì)胞30min后換液,用以上3個(gè)工作濃度的NMDA處理3h;(3)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組:以0.01U/mlTm加0.5×10-4mol/L濃度tTG抑制劑MDC預(yù)處理小腦顆粒細(xì)胞30min后換液,再用以上3個(gè)工作濃度的NMDA共同處理細(xì)胞3h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。tTGmRNA半定量檢測(cè)RT-PCR的方法擴(kuò)增tTGmRNA,以β-actin為內(nèi)參照,Gelpro圖像分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。用DEPC水配制并預(yù)冷至4℃的PBS清洗細(xì)胞3次;采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)樣品RNA總量。取RNA4μg,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。取第一鏈cDNA2μl,同一反應(yīng)體系內(nèi)PCR擴(kuò)增tTG及β-actin。引物序列:tTG(上游:5′GTTCCTGAAGGACCGTAGC3′,下游:5′GTTCCTGAAGG-ACCGTAGC3′),β-actin(5′CCTATGAGACAGCCAGAAT-C3′,下游:5′TCTTCATGGTGCTAGGAGCCT3′)。反應(yīng)條件:95℃變性1min,57℃退火1min,72℃延伸1min,35次循環(huán)。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料結(jié)果(xˉ±s)(xˉ±s)表示,數(shù)據(jù)比較采用方差分析和q檢驗(yàn)。結(jié)果1.凝血酶預(yù)處理對(duì)mda細(xì)胞凋亡的影響空白對(duì)照組NMDA3個(gè)濃度誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率分別為(8.3±0.5)%、(14.1±1.1)%和(26.8±1.9)%;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)0.01U/ml濃度的凝血酶預(yù)處理30min再加入以上3個(gè)工作濃度NMDA,各濃度NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率均較空白對(duì)照組升高,分別為(15.1±0.8)%、(23.8±0.7)%、(33.7±2.1)%(P<0.01)。提示經(jīng)凝血酶預(yù)先處理后同樣濃度的NMDA引起的細(xì)胞凋亡率升高,說(shuō)明NMDA受體敏感性增高。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組同時(shí)加入0.01U/ml濃度Tm和0.5×10-4mol/LMDC處理細(xì)胞30min后,再加入以上3個(gè)濃度的NMDA,細(xì)胞凋亡下降至(5.8±1.2)%、(11.5±1.5)%和(19±1.7)%,且低于單純NMDA處理的空白對(duì)照組(P<0.05);提示MDC抑制了凝血酶引起的NMDA受體敏感性增高。2.nmda濃度以RT-PCR的方法檢測(cè)空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組tTGmRNA,產(chǎn)物大小為309bp;以β-actin作為內(nèi)參照,片斷大小為623bp;marker大小為100~1000bp。1、3和5道為空白對(duì)照組,NMDA濃度分別為0.1×10-4mol/L、0.25×10-4mol/L和0.5×10-4mol/L;2、4、6道為實(shí)驗(yàn)組,NMDA濃度分別為0.1×10-4mol/L、0.25×10-4mol/L和0.5×10-4mol/L。空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)均有tTGmRNA的逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物。3.不同nmda濃度的現(xiàn)實(shí)中tmna的表達(dá)量比較以Gelpro圖像分析軟件對(duì)RT-PCR產(chǎn)物(圖1)進(jìn)行灰度分析,以tTG產(chǎn)物A值與β-actinA值的比值做Y軸,以NMDA劑量作為X軸。比較同一NMDA濃度有無(wú)凝血酶處理(實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組)細(xì)胞內(nèi)tTGmRNA產(chǎn)物量的多少(圖2)。在各個(gè)NMDA濃度,凝血酶預(yù)處理細(xì)胞均較無(wú)凝血酶預(yù)處理細(xì)胞內(nèi)tTG/β-actinA比值高,提示凝血酶處理后再加NMDA的細(xì)胞內(nèi)tTGmRNA量增加(P<0.05,<0.01)。凝血酶預(yù)處理對(duì)大鼠細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的影響凝血酶是一種多功能絲氨酸蛋白酶,其在出血性腦血管病中對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性越來(lái)越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)凝血酶可以通過(guò)細(xì)胞毒性和破壞血腦屏障導(dǎo)致腦水腫,也可以引起大腦各個(gè)不同部位的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Melissa等還發(fā)現(xiàn)凝血酶激活PAR-1受體能使大鼠小腦顆粒細(xì)胞NMDA受體敏感性增高兩倍,人工合成PAR-1受體激活劑SFLLRN亦可以產(chǎn)生相同作用;這種作用可以被凝血酶抑制劑hirudin阻斷,在缺乏PAR-1受體基因缺陷鼠則明顯減弱,但機(jī)制不清。NMDA受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛存在的一種興奮性受體,其過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流,造成神經(jīng)細(xì)胞腫脹及異常電活動(dòng)。有回顧性研究發(fā)現(xiàn)腦出血后早期癲癇的發(fā)生率為6.19%,且多與皮層的出血有關(guān)。我們采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)同一濃度NMDA在不同干預(yù)條件下引起不同細(xì)胞凋亡率的方法比較NMDA受體敏感性的變化。研究發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率隨著NMDA劑量的升高而增高,NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率有NMDA劑量依賴(lài)性;實(shí)驗(yàn)組預(yù)先凝血酶處理30min后,再用NMDA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,檢測(cè)到的細(xì)胞凋亡率仍有NMDA劑量依賴(lài)性,而且預(yù)處理后各NMDA濃度細(xì)胞凋亡率均升高(P<0.01),提示凝血酶預(yù)處理后大鼠小腦顆粒細(xì)胞對(duì)NMDA的敏感性升高。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組在Tm預(yù)處理的同時(shí)加入了tTG抑制劑MDC后再加入NMDA,3種濃度的NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率均較實(shí)驗(yàn)組下降(P<0.01),提示MDC抑制tTG酶降低了NMDA受體敏感性。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組MDC使細(xì)胞凋亡率降低,甚至低于空白對(duì)照組(P<0.05),提示MDC不僅抑制了凝血酶引起的NMDA受體敏感性升高,而且還降低了NMDA受體激活本身引起的細(xì)胞凋亡,這提示tTG也可能參與了NMDA受體激活引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程。為了比較空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)tTG的量,我們檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)tTGmRNA的變化。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)均有tTGmRNA擴(kuò)增產(chǎn)物,且組內(nèi)和組間的產(chǎn)物量均有差異(圖1)。通過(guò)Gelpro圖像分析軟件對(duì)RT-PCR產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn),在各個(gè)NMDA濃度,凝血酶預(yù)處理后再加入NMDA的小腦顆粒細(xì)胞內(nèi)(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組)的tTGmRNA的量均較空白對(duì)照組(單獨(dú)NMDA處理)高,顯示凝血酶預(yù)處理能增加細(xì)胞內(nèi)tTGmRNA的量。我們推測(cè)凝血酶影響NMDA受體敏感性的機(jī)制可能是凝血酶激活PAR-1受體后使細(xì)胞內(nèi)無(wú)活性的tTG酶蛋白表達(dá),而NMDA受體激活后進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)tTG的量。同時(shí),NMDA受體激活引起的Ca2+內(nèi)流增加,使Ca2+依賴(lài)性的tTG均被激活。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)凝血酶激活PAR-1受體在誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的同時(shí)細(xì)胞內(nèi)tTG酶蛋白表達(dá)增加和酶活性升高,tTG參與凝血酶通過(guò)PAR-1受體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑,而本次研究發(fā)現(xiàn)tTG在小腦顆粒細(xì)胞內(nèi)也是凝血酶通過(guò)PAR-1受體影響NMDA受體的中間物質(zhì)聯(lián)系。這提示tTG不僅直接參與PAR-1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑,可能有其他受體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)物質(zhì),在凝血酶對(duì)中樞神經(jīng)毒性機(jī)制中起著非常重要的作用。tTG具有兩種酶活性,除了肽鏈交聯(lián)作用外還有GTP結(jié)合蛋白作用。tTG可能通過(guò)前者參與凋亡小體的形成和穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)等一般凋亡過(guò)程,也可能通過(guò)后者干擾GTP的轉(zhuǎn)化和代謝過(guò)程從而干擾其他GTP相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑。而后者可能是tTG產(chǎn)生多種生理及病理作用并干擾其他受體信號(hào)途徑的原因。凝血酶對(duì)中樞神