鱘類志賀鄰單胞菌病病原診斷技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鱘類志賀鄰單胞菌病診斷的術(shù)語和定義、試劑和材料、設(shè)備和器材、臨床檢查、實驗室樣品采集、細(xì)菌分離與純化、細(xì)菌鑒定、結(jié)果判定和綜合判定等技術(shù)規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于達(dá)氏鱘（Acipenserdabryanus）和西伯利亞鱘（Acipenserbaerii）的類志賀鄰單胞菌的診斷。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢測染色法、培養(yǎng)基和試劑GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB/T18652致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法SC/T7014水生動物檢疫實驗技術(shù)規(guī)范SC/T7013水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范SC/T7201.1魚類細(xì)菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。鱘類志賀鄰單胞菌病指由類志賀鄰單胞菌（Plesiomonasshigelloides）感染引起達(dá)氏鱘和西伯利亞鱘發(fā)病或死亡的一種細(xì)菌性疾病。試劑和材料試劑、染色液和培養(yǎng)基檢驗中所需試劑、染色液與培養(yǎng)基的配制按照GB/T4789.28、GB/T18652和SC/T7014規(guī)定執(zhí)行，Taq酶、dNTPs、10×PCR緩沖液（無Mg2+），DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物選用專業(yè)試劑公司提供的商品化試劑；微生物生化鑒定管可替代相應(yīng)鑒定培養(yǎng)基或鑒定試劑，上述未提及的見附錄A。水 應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。引物16SrRNA基因DNA序列擴(kuò)增引物，P-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，P-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，-20℃保存。設(shè)備與器械超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、水平電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、普通光學(xué)顯微鏡、PCR擴(kuò)增儀、電子天平、微量移液器、普通冰箱、解剖盤、剪刀、鑷子、手術(shù)刀、培養(yǎng)皿、鉑耳絲、酒精燈等。臨床檢查臨床癥狀病魚反應(yīng)遲鈍，離群獨游，游動遲緩或側(cè)翻，攝食減少或停止攝食。體表檢查病魚鰭條基部不同程度的充血、出血；部分病魚無明顯外部病變而死亡。剖檢胃腸道腸腔內(nèi)有少量淡黃色的粘液；肝臟腫大充血，出血；部分病魚腸道無明顯的變化。實驗室樣品采集樣品采集按SC/T7013執(zhí)行。細(xì)菌分離與純化在無菌的環(huán)境中，用滅菌鉑耳分別勾取病魚的肝、腎，劃線接種至LB固體培養(yǎng)基，28℃培育24-48小時，從中挑取圓形、隆起、光滑、邊緣整齊的單個菌落在LB平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基的配制方法見附錄A.1。細(xì)菌鑒定革蘭氏染色按GB/T4789.28中2.2的規(guī)定執(zhí)行。生理生化試驗9.2.1葡萄糖利用試驗按SC/T7201.1中的規(guī)定執(zhí)行，培養(yǎng)基變黃色為陽性。9.2.2乙酰甲基甲醇（V-P）試驗按SC/T7014中表2的規(guī)定執(zhí)行。有氣泡產(chǎn)生為陽性；無氣泡產(chǎn)生為陰性。9.2.3氧化酶試驗以毛細(xì)管吸取四甲基對二苯胺的1%水溶液滴在細(xì)菌的菌落上。菌落呈玫瑰紅色、深紫色為陽性，不變色為陰性。9.2.4吲哚試驗按SC/T7014表2的吲哚（靛基質(zhì)）試驗的規(guī)定執(zhí)行。培養(yǎng)基變紅為陽性；不變紅為陰性。9.2.5糖、醇類（葡萄糖、甘露醇）發(fā)酵試驗將待檢菌穿刺接種于糖、醇類發(fā)酵試驗培養(yǎng)基（A.2），28℃培養(yǎng)24h后觀察。培養(yǎng)基變黃色為陽性，不變黃色為陰性。16SrRNA基因序列測定與同源性分析9.3.1細(xì)菌基因組DNA抽提取2mL待檢菌培養(yǎng)液，12000r/min離心1min，收集菌體。菌體懸浮于500μLTE緩沖液（pH8.0）（A.3），震蕩懸浮，加入50μL10％的SDS溶液（A.4），10μL20mg/mL的蛋白酶K（A.5），混勻，37℃溫育1h。加入100μL5mol/L的NaCl溶液（A.6），充分混勻，再加入100μLCTAB/NaCl溶液（A.7）混勻，65℃溫育20min。加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）（A.8），混勻，12000r/min離心5min。取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）（A.9），混勻，12000r/min離心5min。取上清液，加入1倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜置10min，10000r/min離心10min；沉淀用70％酒精洗滌2次，室溫晾干。加入50μL的TE緩沖液溶解，-20℃貯存，備用。9.3.216SrRNA基因擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液（無Mg2+）5.0μL，MgCl2（25mmol/L）5.0μL，dNTPs（10mmol/L）1.0μL，引物（20μmol/L）P-F和P-R各1.0μL，TaqDNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足至50μL。混勻后，3000r/min離心30s。設(shè)空白對照，空白對照取等體積的雙蒸水代替DNA模板。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保溫。9.3.3X脂糖凝膠電泳用TAE電泳緩沖液（A.10）配制1％的X脂糖平板，凝固后放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將上述6μL樣品和2μL溴酚藍(lán)指示劑溶液（A.11）混合后加入樣品孔，使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物作對照。120V電泳約20-40min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時停止。于紫外光下觀察，并在長波紫外燈下用刀片切下含目的條帶（約1500bp）的膠塊，放入無菌離心管中稱重。9.3.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、測序、序列比對9.3.4.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化9.3.4.1.1按每0.1gX脂糖凝膠加0.1mL酚，將酚加入9.3.3含有目的條帶膠塊的離心管中。9.3.4.1.2經(jīng)漩渦震蕩儀震蕩1min-2min，將離心管在-70℃放置1h，使凝膠完全凍結(jié)。9.3.4.1.337℃水浴將凍結(jié)的凝膠融化后，在漩渦震蕩儀上震蕩1min-2min；14000r/min離心5min。9.3.4.1.4取上層水相轉(zhuǎn)入另一個離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25﹕24﹕1）（A.8），混勻，12000r/min離心5min。9.3.4.1.5取上清液加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）（A.9），混勻，12000r/min離心5min。9.3.4.1.6向收集的水溶液中加入1/10體積的3mol/L的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，置-20℃過夜或-70℃放置1h-2h。9.3.4.1.714000r/min離心10min，棄上清。9.3.4.1.8將沉淀的DNA溶于適當(dāng)體積的TE緩沖液（A.3）中，置-20℃保存，待測。9.3.4.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序與同源性分析將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，并與參考序列（附錄B）進(jìn)行比對分析。10結(jié)果判定10.1菌落形態(tài)28℃培養(yǎng)18h-30h，形成圓形、隆起、光滑、邊緣整齊的菌落。10.2細(xì)菌染色革蘭氏染色為陰性短桿菌。10.3生理生化試驗生理生化反應(yīng)試驗結(jié)果見表1表1類志賀鄰單胞菌的生理生化反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)項目結(jié)果反應(yīng)項目結(jié)果反應(yīng)項目結(jié)果氧化酶+甘露醇-V-P-吲哚+葡萄糖+注：“+”為陽性，“-”為陰性10.416SrRNA基因序列測定與同源性分析測定的16SrRNA基因序列與附錄B所列的基因序列比較，同源性達(dá)98%以上。11綜合判定符合以下所有特征者判定為類志賀鄰單胞病a）臨床癥狀與6相符；b）菌落形態(tài)和染色觀察與10.1和10.2相符；c）生理生化反應(yīng)結(jié)果與10.3相符；d）16SrRNA基因序列同源性分析結(jié)果與10.4相符；附錄A（規(guī)范性附錄）試劑配方A.1LB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl5gX脂或者X脂糖15g蒸餾水1000mL，115℃滅菌20min。A.2糖、醇類發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨2gNaCl5gK2HPO40.2g被測糖或醇類10gX脂6g溴百里酚藍(lán)1％水溶液3mL（溴百里酚藍(lán)先用少量95％乙醇溶解后，再加水配制1％的水溶液）蒸餾水1000mL，分裝試管，培養(yǎng)基高度約4.5cm，115℃滅菌20min。A.3TE緩沖液（pH8.0）Tris堿（分子量121.1）0.121g乙二胺四乙酸二鈉（分子量372.24）0.0372g加入80mL雙蒸水中，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，加雙蒸水定容至100mL，室溫保存。A.410％SDS溶液將10g十二烷基硫酸鈉加入80mL雙蒸水中，加熱至68℃助溶，再加入雙蒸水定容至100mL，室溫保存。A.5蛋白酶K（20mg/mL）將蛋白酶K溶解于雙蒸水中，至終濃度20mg/mL，分裝入小管，置-20℃保存。A.65mol/L的NaCl溶液將29.22gNaCl（分子量58.44）溶解于80mL雙蒸水中，再加雙蒸水定容至100mL，室溫保存。A.7CTAB/NaCl溶液4.1gNaCl溶解于80mL雙蒸水中，緩慢加入10gCTAB，再加雙蒸水定容至100mL，室溫保存。A.8酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）將25體積的酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中，上面加上TE緩沖液，4℃保存。A.9氯仿：異戊醇（24:1）將24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中。A.1050×TAE電泳緩沖液在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸和50ml0.5/LEDTA。再加雙蒸水定容至500mL，室溫保存。使用時，配成1×TAE電泳緩沖液。A.11溴酚藍(lán)指示劑溶液6×上樣緩沖液將溴酚藍(lán)100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍(lán)溶液中，搖勻后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，調(diào)至藍(lán)色。附錄B（資料性附錄）類志賀鄰單胞菌16SrRNA基因參考序列（1415bp）AAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCCGCCCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAAGTTGAGCTCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATGCCACTAGGTATTAACTAGTGACCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAG