軟骨下骨吸收陷窩對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨病理變化和軟骨下骨的影響

骨關(guān)節(jié)炎（oa）是一種慢性、進(jìn)展性和退行性變行性疾病。本研究通過建立大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型,采用HE染色記數(shù)軟骨下骨吸收陷窩數(shù)目和分級(jí),檢測(cè)軟骨組織金屬蛋白酶-13(MMP13)的表達(dá),并進(jìn)行軟骨下骨骨組織計(jì)量學(xué)分析,探討在病理狀態(tài)下軟骨下骨骨吸收陷窩對(duì)軟骨病理變化和軟骨下骨的影響及中藥對(duì)其的影響。1材料和方法1.1材料和模型選取5月齡未孕SD雌性大鼠24只,體重(240±20)g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):粵監(jiān)證號(hào)2005A031SCXK(粵)2003-0001。采用Rrandrom軟件隨機(jī)分為4組各6只。參照文獻(xiàn)造模。A組為正常組,B組切斷右膝前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶(ACLT),C組ACLT+扶他林組,D組ACLT+中藥組。1.2含量4.0%c/ml混懸液中藥補(bǔ)腎方由熟地黃、補(bǔ)骨脂、丹參、黃芪等10味中藥組成。按照人與大鼠體表面積折算,其含生藥量0.8377g/mL(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院制劑室提供)。扶他林緩釋片(北京諾華制藥有限公司產(chǎn)品,批號(hào)05007),配制成6.3mg/mL的混懸液。C、D組按6mL/kg灌服,每天1次;A、B組灌同劑量生理鹽水。1.3膝關(guān)節(jié)he染色及mmp13檢測(cè)于術(shù)后18周處死大鼠,取右側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨干骺端,將膝關(guān)節(jié)周圍肌肉剔除干凈,于其下1.5cm處離斷保存,4%多聚甲醛固定,備行HE染色和MMP13免疫組化檢測(cè)。1.4大鼠冠狀面he染色和骨形態(tài)檢測(cè)修整組織塊后石蠟包埋,每組取3只大鼠作冠狀面不連續(xù)切片,每個(gè)標(biāo)本切10張,間隔100μm切片,各取5張分別行HE染色和骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。1.5小鼠血清中mmp13的檢測(cè)修整組織塊后石蠟包埋,每組取3只大鼠行額狀面切片后,每個(gè)標(biāo)本切5張,間隔100μm,切片滴加3%H2O2室溫10min,復(fù)合消化液消化10min滴加正常小羊血清50μL,滴加1:400稀釋MMP13(武漢博士得公司)。適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記IgG,37℃孵育30min,PBS洗5min/次×3。滴加1:1000稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素,DAB顯色5～10min,蒸餾水洗,蘇木紫復(fù)染10min,蒸餾水洗。常規(guī)脫水、二甲苯透明、樹脂膠封固,顯微鏡觀察。1.6骨小梁體積及距離測(cè)量參數(shù)選取HE切片在HMIAS22000圖像分析系統(tǒng)(廣東醫(yī)學(xué)院骨形態(tài)計(jì)量室)下行骨組織形態(tài)計(jì)量分析。每例標(biāo)本3張,每張隨機(jī)取6個(gè)視野,測(cè)量后取平均值。測(cè)量參數(shù)包括:①骨體積(BV/TV):測(cè)量范圍內(nèi)骨小梁體積占全部骨組織體積的百分比,反映骨小梁分布密度;②骨小梁厚度(Tb.Th):骨小梁兩側(cè)面之間的平均距離;即2000×骨小梁面積/1.99×骨小梁周長(zhǎng);③骨小梁數(shù)目(Tb.N):1.99×骨小梁周長(zhǎng)/2×總面積;④骨小梁分離度(Tb.Sp):即2000×(總面積-骨小梁面積)/1.99×骨小梁周長(zhǎng)。1.7顯色指數(shù)的計(jì)算免疫組化結(jié)果半定量判斷參照每張切片不同部位隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野,分別記錄顯色程度和顯色范圍。顯色程度分弱(+)、中(++)、強(qiáng)(+++)表示。顯色范圍分:顯色范圍占高倍視野<1/4為(+),占1/4～2/4為(++),占2/4～3/4為(+++),>3/4為(++++)。然后將每個(gè)高倍視野顯色程度和范圍換算成顯色指數(shù),顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍(+,++,+++,++++分別按1、2、3、4分計(jì)算)。取均數(shù)為每一種類蛋白表達(dá)的最終顯色指數(shù)。1.8統(tǒng)計(jì)方法用SPSS11.5軟件包統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以表示。2結(jié)果2.1軟骨下骨he染色見圖1。HE染色后對(duì)軟骨下骨吸收陷窩進(jìn)行分級(jí)和記數(shù)。A:正常軟骨下骨HE染色定級(jí)為0;B:吸收陷窩通過軟骨下骨的鈣化層但未通過潮線,定級(jí)為1;C:吸收陷窩通過潮線進(jìn)入軟骨組織,定級(jí)為2。2.2級(jí)陷窩數(shù)目p,l見表1。4組大鼠均減少未見到0級(jí)陷窩;1級(jí)陷窩組間比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。與B組比較,A、D組2級(jí)陷窩數(shù)目減少,差異有非常顯著性意義(P<0.01);與A組比較,C、D組差異有顯著性意義(P<0.05)。2.2mmp13顯色指數(shù)值見表2。與A組比較,B、C、D組MMP13顯色指數(shù)值升高,差異有非常顯著性意義(P<0.01)。與B組比較,C、D組MMP13顯色指數(shù)值較低,差異有非常顯著性意義(P<0.01)。與C組比較,D組MMP13顯色指數(shù)值較低,差異有非常顯著性意義(P<0.01)。2.3各組tb.1n值的比較見表3。各組大鼠軟骨下骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV%)比較:實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),B、C組均有不同程度升高,與A組比較,差異有非常顯著性意義(P<0.01);與B組比較,C、D組BV/TV%值降低,差異有非常顯著性意義(P<0.01);A、D2組比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。各組間Tb.Th及Tb.1N值比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。與B組比較,A、D組Tb.Sp值升高,差異有非常顯著性意義(P<0.01)。3小鼠軟骨下骨骨吸收陷窩及模擬檢測(cè)骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以漸進(jìn)性的軟骨破壞和軟骨下骨重建為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病,最終導(dǎo)致軟骨下骨硬化和骨體積的增加。近來越來越多的研究表明骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)生的骨重塑異常改變了軟骨下骨的材料學(xué)特征,損害了其吸收應(yīng)力的作用,喪失對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)功能。本實(shí)驗(yàn)旨在探討在在病理狀態(tài)下數(shù)軟骨下骨骨吸收陷窩對(duì)軟骨病理變化和軟骨下骨的影響及中藥對(duì)其的作用。本研究中采用軟骨下骨骨吸收陷窩來描述軟骨組織和骨髓之間的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)中術(shù)后18周大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中看到了良好的骨吸收陷窩,可能原因之一是在大鼠模型理論上關(guān)節(jié)炎評(píng)分較高。在正常大鼠和關(guān)節(jié)炎模型大鼠都可以看到骨吸收陷窩,1級(jí)陷窩4組比較未見明顯意義,說明骨吸收陷窩可能作為軟骨營(yíng)養(yǎng)的通道。軟骨的潮線作為防止軟骨礦化和鈣化的重要防線,有著重要的意義;在OA大鼠中可以觀測(cè)到2級(jí)陷窩,而且2級(jí)陷窩數(shù)目與B組比較,A、D組2級(jí)陷窩數(shù)目差異有顯著性意義(P<0.01);與A組比較,C、D組意義也有顯著性意義(P<0.05),結(jié)合骨組織計(jì)量學(xué)分析,B組軟骨下骨厚度(Tb.Th)和骨小梁數(shù)目(Tb.N)與A、D組差異無顯著性意義,但骨小梁分離度(Tb.Sp)與A、D組比較有顯著性意義,表明:①大鼠OA存在骨形成增加,這種骨體積的增加是通過增加骨小梁數(shù)目實(shí)現(xiàn)的;②骨陷窩的形成可能同機(jī)械負(fù)荷有關(guān),骨陷窩可能是軟骨下骨骨重建的通道之一。D組大鼠軟骨下骨厚度明顯低于模型組,骨小梁數(shù)目也明顯低于模型組,說明中藥可抑制OA骨形成增加,減輕軟骨下骨硬化,減少2級(jí)骨陷窩的形成。而C組形態(tài)計(jì)量學(xué)表明,盡管西藥可以明顯改變臨床癥狀,但骨形成增加,不能減少骨陷窩數(shù)目,不能減輕軟骨下骨礦化。MMP13是近年來在OA發(fā)病機(jī)制中研究得較多的幾個(gè)指標(biāo)之一。在本次研究中,MMP13免疫組化陽性細(xì)胞表達(dá)顯色指數(shù)出現(xiàn)明顯差異,與A組比較,B、C、D組MMP13顯色指數(shù)明顯升高。與B組比較,C、D組差異有顯著性意義(P<0.01)。B組MMP13表達(dá)增高同其2級(jí)骨陷窩數(shù)目較多存在一致性。表明中藥可以抑制MMP13在軟骨細(xì)胞中的表達(dá),降低軟骨降解的程度。綜上所述,筆者認(rèn)