蛋白質濃度的測定實驗報告實驗內容本次實驗我們學習考馬斯亮藍G-250法測試豆芽的蛋白質含量。（1）取六支具塞試管，編號后按下表加入試劑。（2）蓋上塞子搖勻，放置2分鐘，以1號試管溶液作為對照液在595nm波長下比色測定(比色應在1min內完成）以牛血清蛋白含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪出標準曲線。（3）接下來準確稱取約200mg綠豆芽下胚軸，放入研缽中加入5ml蒸餾水研磨成勻漿，離心4000r/min,10min。另取一支具塞試管，準確加入0.1ml樣品提取液，再加入0.9ml蒸餾水，5ml考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，放置2min后，以標準曲線1號試管溶液作為對照溶液，在595nm波長下比色，記錄吸光度值。（4）實驗結果。注意事項1.蛋白質所測的OD值一定要位于標準曲線范圍內，因為G-250的曲線隨著蛋白濃度增高有些略微偏離線性，若蛋白質濃度太高，可適當稀釋后再測。2.用于標準樣品的牛血清白蛋白最好現(xiàn)配現(xiàn)用，已經配好的溶液即使是-20度保存一段時間后也會造成結果偏高。3.大量的去污劑如TritonX-100、SDS等會嚴重干擾測定。4.蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合的反應十分迅速,在2min左右反應達到平衡;其結合物在室溫下1h內保持穩(wěn)定.因此測定時，不可放置太長時間,否則將使測定結果偏低?？偨Y通過這個實驗，我們可以學習到蛋白質相關知識，能夠增強動手能力，提高實驗技能，希望同學們在操作過程中要注意以上事項，提前預習，做好準備工作!

蛋白質的含量測定的五種經典方法1.凱式定氮法原理:蛋白質是含氮的有機化合物。蛋白質與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，蛋白質含量。2.紫外吸收法原理:蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm附近具有最大吸收，且各種蛋白質的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定280nm處的吸光度值可用于蛋白質含量的測定。3.雙縮脲法原理:雙縮脲是兩個分子脲經180°C左右加熱，放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4,形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或通過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物在540nm處有最大吸收，顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。4.Folin-酚試劑法原理:此法是雙縮脲法的發(fā)展，在堿性溶液中銅-蛋白質復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin試劑)，.產生深藍色(鉬藍和鎢藍混合物)。在一定的條件下，藍色深淺與蛋白質的量成正比。5.考馬斯亮藍法原理:考馬斯亮藍G-250染料在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也有棕黑色變?yōu)樗{色，在595nm下測定的吸光度值與蛋白質的濃度成正比。五種方法的對比表格考馬斯亮藍法的突出優(yōu)點和缺點優(yōu)點(1)靈敏度高,據(jù)估計比Lowry法約高四倍,其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大,蛋白質——染料復合物有更高的消光系數(shù),因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。(2)測定快速、簡便，只需加一種試劑，完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。(3)干擾物質少：如干擾Lowry法的鉀、鈉、鎂離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。缺點(1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g-球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。(2)仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有:去污劑、T