羊抗人igg多克隆抗體的臨床應(yīng)用研究

經(jīng)典的免疫理論認(rèn)為，免疫球蛋白（ig）基因僅在b細(xì)胞的發(fā)育過程中進(jìn)行選擇性重組，因此免疫球蛋白是b細(xì)胞的特征性產(chǎn)物。邱曉彥等利用多種方法證明了上皮樣腫瘤細(xì)胞以及腫瘤組織也能夠分泌產(chǎn)生IgG。Chen等又在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了詳細(xì)的驗(yàn)證,確證了Ig在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。這一新理論的提出不僅對B細(xì)胞分泌Ig的經(jīng)典理論提出了置疑和挑戰(zhàn),同時(shí)也引起了人們的思考,即腫瘤細(xì)胞分泌的Ig是否可以作為新靶點(diǎn)用于腫瘤放射免疫顯像和靶向治療。本工作即擬以此為出發(fā)點(diǎn),用125I標(biāo)記羊抗人IgG多克隆抗體,觀察其在荷人結(jié)腸癌裸鼠中的分布,探討放射性核素標(biāo)記的針對腫瘤細(xì)胞分泌的免疫球蛋白的抗體作為新型腫瘤放射免疫顯像和治療藥物的可能性。1實(shí)驗(yàn)材料1.1免疫組化檢測CRC-15R放射性活度計(jì):美國Capintec公司;1470-002全自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀:芬蘭PerkinElmer公司;AR-2000放射性薄層掃描儀:美國Bioscan公司;ITLC-SG:美國Gelman公司;PD-10脫鹽柱(SephadexG-25):瑞典AmershamBioscience公司;羊抗人IgG多克隆抗體(GAHG)、羊IgG(GIgG):美國Sigma公司;Iodogen(1,3,4,6-四氯3,6-二苯-甘脲):美國Sigma公司;Na125I溶液(無載體):放射性濃度為3.7～7.4PBq/L,美國PerkinElmerLifeScience公司;其它試劑均為國產(chǎn),分析純。人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)同位素研究中心傳代細(xì)胞。1.2裸鼠性別、體重BALB/c小白鼠:5只,SPF級(jí),雌性,6～7周齡,體重18～22g。BALB/c裸鼠:22只,SPF級(jí),雌性,4～5周齡,體重15～17g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。2實(shí)驗(yàn)方法2.11標(biāo)記率和放化純度的測定采用Iodogen法,在預(yù)先包被50μgIodogen的標(biāo)記小瓶中,依次加入150μL0.1mol/L,pH7.4磷酸(PB)緩沖液,100μgGAHG(10μL),以及37～74MBqNa125I(10μL),室溫振搖反應(yīng)10min,然后用PD-10脫鹽柱進(jìn)行純化。反應(yīng)后樣品以及純化后的樣品均點(diǎn)樣到ITLC-SG,在85%的甲醇展開體系中展開,用放射性薄層掃描儀測定其標(biāo)記率和放化純度。用同樣的方法進(jìn)行羊IgG(GIgG)的標(biāo)記并測定其標(biāo)記率和放化純度,用于陰性對照實(shí)驗(yàn)。2.2體外穩(wěn)定性測定取100μL純化后的125I-GAHG分別加入到900μL生理鹽水(NS)、胎牛血清(FBS)和裸鼠血清(NMS)中,37℃振搖,孵育不同時(shí)間(0、4、24、48、72h),測放化純度,評價(jià)其體外穩(wěn)定性。2.3血液百分注射劑量率測量5只BALB/c小白鼠,每只經(jīng)尾靜脈注射100μL125I-GAHG(370kBq,2μg),分別于注射后不同時(shí)間點(diǎn)(5、12、30min,1、2、4、8、11、22、34、48、72h)眼眶取血,稱重并用γ計(jì)數(shù)儀測量其放射性計(jì)數(shù),計(jì)算每克血液百分注射劑量率(%ID/g)。采用GraphPrism軟件進(jìn)行分析,計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。2.4%co人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2的飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。取22只裸鼠,每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種5×106個(gè)細(xì)胞,SPF條件下飼養(yǎng),待腫瘤直徑長至約1.0cm時(shí)(2～3周),用于顯像和生物分布實(shí)驗(yàn)。2.5i-ga戰(zhàn)略取6只荷瘤裸鼠,于顯像前3天開始飼以含1%KI的無菌飲用水,封閉甲狀腺。將其分為3組,每組2只,一組用于尾靜脈注射125I-GAHG,另一組用于尾靜脈注射125I-GIgG,第三組用于腫瘤局部注射125I-GAHG。每只裸鼠分別注射13.32MBq(100μL,～28μg)125I-GAHG或125I-GIgG,并分別于注射后4、48、72、148h將裸鼠仰臥位固定于配有低能高分辨平行孔準(zhǔn)直器的雙探頭γ相機(jī)(Siemens,E.CAM)下進(jìn)行平面顯像。2.61百分注射劑量率測定16只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組,每組4只。每只由尾靜脈注射563.5kBq(100μL,2.5μg)125I-GAHG,并于注射后24、72、120和168h按組將實(shí)驗(yàn)裸鼠斷頸處死,取血液及主要臟器和組織,稱重并測量放射性計(jì)數(shù),計(jì)算各器官或組織的百分注射劑量率(%ID/g)。3結(jié)果與討論3.11反應(yīng)產(chǎn)物的純化純度不高,產(chǎn)品品質(zhì)不高,產(chǎn)品品質(zhì)不高,產(chǎn)品目錄不多,聚合反應(yīng)產(chǎn)物2.GAHG及對照GIgG經(jīng)Iodogen法標(biāo)記后,其標(biāo)記率>85%。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)PD-10柱純化后,其放化純度均大于98%。在85%的甲醇展開體系中,游離125I的Rf為0.7～0.8,125I標(biāo)記物的Rf為0～0.1。3.2標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性125I-GAHG在3種不同體系中的放化純度示于圖1。在觀測的72h內(nèi),125I-GAHG在NS、FBS和NMS3種體系中的放化純度基本保持在95%以上,無明顯脫碘現(xiàn)象,說明標(biāo)記物具有良好的體外穩(wěn)定性。3.3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析125I-GAHG在血液中的清除曲線示于圖2。采用GraphPrism軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,經(jīng)擬合符合二室模型(R2=0.98),其分布相半衰期T1/2α為1.19h,消除相半衰期T1/2β為43.99h。3.4東血酸鈉h,k和類化藥在腫瘤組織中的特異性耐藥每組中的兩只荷瘤裸鼠顯像結(jié)果相似,其中1只小鼠的代表性圖像示于圖3。由圖3可以看出,注射125I-GAHG或125I-GIgG的荷瘤裸鼠,在注射后48h時(shí)腫瘤部位清晰可見,隨著放射性標(biāo)記物在正常組織的代謝和在腫瘤部位的繼續(xù)濃聚,注射后168h時(shí)腫瘤部位的顯像更加清晰。兩種標(biāo)記物的顯像結(jié)果相比,注射后4h,二者無明顯差異,但隨著時(shí)間的延長,125I-GAHG在腫瘤部位的攝取均要明顯高于125I-GIgG,并且全身的本底低于125I-GIgG,證明了125I-GAHG在腫瘤部位的特異性攝取。腫瘤內(nèi)局部注射125I-GAHG的荷瘤裸鼠,腫瘤部位始終呈現(xiàn)很強(qiáng)的放射性濃聚,即使注射后168h,放射性物質(zhì)仍基本濃聚在腫瘤部位,沒有明顯的臟器趨向性,說明了腫瘤局部給藥后,125I-GAHG能夠很好地滯留在腫瘤部位。對于正常羊IgG(GIgG)的γ顯像,其腫瘤攝取也高于其它正常組織,分析認(rèn)為,由于大分子物質(zhì)在實(shí)體瘤中具有增強(qiáng)的滲透和滯留效應(yīng)(EnhancedPermeabilityandRetention,EPR),使得其在透過高通透性血管后不易返回而滯留在腫瘤部位。對于這種陰性抗體在腫瘤部位的濃聚,也有文獻(xiàn)報(bào)道。125I-GAHG在腫瘤部位的濃聚不僅有特異性攝取,也存在EPR效應(yīng)。腫瘤局部注射的顯像結(jié)果表明,抗體在腫瘤部位滯留較好,不易向正常組織擴(kuò)散,這對于核素標(biāo)記抗體用于腫瘤局部注射治療非常重要。3.5治療非靶組織的比較125I-GAHG在荷瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布示于圖5,靶組織/非靶組織的放射性比(T/NT)示于圖6。由圖5可以看出,尾靜脈注射125I-GAHG后,其在荷瘤裸鼠血液中的清除較慢,注射后168h,血液的放射性攝取仍高達(dá)9.44±2.87%ID/g,高于其它組織。這可能與GAHG為全抗分子,具有較高的相對分子質(zhì)量(150000)有關(guān);另外,GAHG在血液中與血漿蛋白的非特異性結(jié)合也可能影響其在血液中的清除。這對于腫瘤的快速顯像是不利的,因?yàn)樵黾恿瞬∪说念~外輻射劑量,但是對于放射免疫治療來說,能夠增加腫瘤的攝取,提高治療效率。兩種已經(jīng)上市的放射免疫治療藥物Zevalin和Bexxar均為治療性核素標(biāo)記的全抗分子。由圖5還可以看出,隨著時(shí)間延長,非靶組織的放射性攝取基本呈逐漸降低趨勢,而腫瘤組織的放射性攝取在注射后第3天出現(xiàn)峰值,為6.71±2.19%ID/g,并始終保持較高的攝取值。相對于其它高特異性的抗體顯像劑來說,這一腫瘤絕對攝取值并不是很高,這可能與腫瘤細(xì)胞中人IgG的表達(dá)水平,以及IgG在HT-29細(xì)胞中80%以上表達(dá)在胞漿內(nèi),細(xì)胞膜IgG的表達(dá)只占IgG表達(dá)總量的20%,而大分子抗體很難透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞漿有關(guān)。由圖6則可以看出,注射后24h,除了腫瘤與血液及肺的T/NT小于1外,其它組織均大于1,并且隨著時(shí)間延長,T/NT基本呈逐漸增大的趨勢。注射后168h,腫瘤與肌肉的T/NT達(dá)到最大,為7.33±