枯草芽孢桿菌ncd-2菌株培養(yǎng)條件的研究

甲殼動物酪氨酸菌是一種優(yōu)良的堿性細菌。在一定條件下，它可以產(chǎn)生較強的抗熱性、紫外、輻射和某些藥物的抗熱性芽。其抗菌譜廣泛,對多種植物病原菌具有潛在的生防利用價值?？莶菅挎邨U菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì),包括多肽類抗生素、抗菌蛋白和揮發(fā)性抗菌物質(zhì)。分離純化利用這類抗菌物質(zhì),特別是抗菌蛋白類物質(zhì)一直是相關研究的熱點之一?？莶菅挎邨U菌NCD-2菌株是河北省農(nóng)林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室分離到的一株有效防治棉花黃萎病的細菌,它通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)達到對大麗輪枝菌的抑制作用,以該菌株作為有效成分的微生物農(nóng)藥(10億/g芽孢枯草芽孢桿菌可濕性粉劑)已完成國家農(nóng)藥登記。本研究通過對該菌株產(chǎn)生抗菌蛋白的最佳條件及抗菌蛋白特性的研究,為進一步純化抗菌蛋白及其應用提供了科學依據(jù)。1材料和方法1.1試驗中的蘑菇NCD-2菌株和棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌菌株均由河北省農(nóng)林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室提供。1.2培養(yǎng)時間的確定NCD-2菌株平板劃線接種,30℃恒溫培養(yǎng)24h。挑取單菌落接種于盛有NB培養(yǎng)液三角瓶中,裝液量為每三角瓶(250mL)中盛有100mLNB培養(yǎng)液,在指定溫度下,搖床振蕩(180r/min)培養(yǎng)一定時間。培養(yǎng)液離心(4500r/min,30min)后,上清液經(jīng)細菌過濾器(φ=0.22μm)過濾則得無菌體培養(yǎng)液。1.3分生孢子懸浮液的制備采用改進牛津杯法即牛津杯雙層培養(yǎng)基法。從在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d的棉花黃萎病病原菌菌落邊緣挑取菌絲塊3～4塊,接種于PDB培養(yǎng)液中,裝液量為每三角瓶(250mL)中盛有100mLPDB培養(yǎng)液,25℃,搖床振蕩(180r/min)培養(yǎng)4d。無菌紗布過濾去菌絲得到分生孢子懸浮液,血球計數(shù)板計數(shù),將分生孢子懸浮液用無菌水調(diào)整為108個/mL。倒PDA培養(yǎng)基為平板下層;在每100mL改良PDA培養(yǎng)基(其中瓊脂含量為0.5%,其他成分與PDA相同)中加入1mL棉花黃萎菌分生孢子懸浮液并混合均勻,倒平板作為上層。在每個雙層平板上均勻放置3個無菌牛津杯。每個牛津杯內(nèi)注入100μL供試樣品,30℃培養(yǎng)2～3d后測量抑菌圈直徑。1.4培養(yǎng)條件的影響按照下列培養(yǎng)條件對NCD-2菌株進行培養(yǎng),制備無菌體培養(yǎng)液,并進行抑菌活性測定。不同培養(yǎng)基的影響:將NCD-2菌株分別接種于NB,LB,LBG,BPY,PDB培養(yǎng)液中,于30℃,搖床振蕩(180r/min)培養(yǎng)2d。培養(yǎng)溫度的影響:將NCD-2菌株分別接種在NB培養(yǎng)液,分別在25,30和37℃,搖床振蕩(180r/min)培養(yǎng)2d。不同pH的影響:將NCD-2菌株接種在初始pH分別為3,5,7,9和11的NB培養(yǎng)液,30℃,搖床振蕩(180r/min)培養(yǎng)2d。培養(yǎng)時間的影響:將NCD-2菌株接種在NB培養(yǎng)液中,30℃,搖床振蕩(180r/min)培養(yǎng),培養(yǎng)時間分別為1,2,3,4,5和6d。1.5中毒菌抗菌酶提取物及性質(zhì)分析1.5.1蛋白粗提液的制備應用NB培養(yǎng)液,對NCD-2菌株進行振蕩培養(yǎng)(30℃,180r/min,2d)。該培養(yǎng)液經(jīng)離心(4500r/min,30min)去除菌體,去菌體培養(yǎng)液加入80%飽和度的硫酸銨,4℃沉淀過夜,離心(4500r/min)30min,收集沉淀物,用磷酸緩沖液(pH7.2)進行溶解,4℃透析過夜(透析袋截流分子量為14000)。透析液用細菌過濾器(φ=0.22μm)過濾除去雜質(zhì)后即為蛋白粗提液。并對該粗提液進行抑菌活性測定。4次重復,以NB培養(yǎng)液作對照。1.5.2硫酸銨分級沉淀的制備應用NB培養(yǎng)液,對NCD-2菌株進行振蕩培養(yǎng)(30℃,180r/min,2d)。該培養(yǎng)液經(jīng)離心(4500r/min,30min)去除菌體,去菌體上清液中先加入30%飽和度的硫酸銨,4℃沉淀過夜,收集沉淀,溶于3mL磷酸緩沖液(pH7.2)中。其上清液調(diào)整硫酸銨飽和度至40%,同上制備得到30%～40%的鹽析沉淀物,以此類推分別制備40%～50%,50%～60%,60%～70%,70%～80%和80%～90%的鹽析沉淀物。各沉淀物經(jīng)透析脫鹽后進行抑菌活性測定,4次重復,以NB培養(yǎng)液作對照。1.5.3酶的i處理將蛋白粗提液分別用蛋白酶K、胰蛋白酶和RNaseI處理,每種酶使用濃度500μg/mL,37℃處理1h。對處理后的樣品溶液進行抑菌活性測定,未經(jīng)蛋白酶處理的NCD-2菌株蛋白粗提液為對照,4次重復。1.5.4抑菌活性測定NCD-2菌株蛋白粗提液經(jīng)60,80,100和121℃各處理30min后進行抑菌活性測定,設常溫保存的NCD-2菌株蛋白粗提液為對照,4次重復。1.6數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析本試驗有關數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SAS6.04版本軟件(SASInstituteInc)2結果與分析2.1抑菌圈測定結果菌株NCD-2的無菌培養(yǎng)液對棉花黃萎菌的抑制作用測定結果表明,供試樣品周圍出現(xiàn)大而清晰的抑菌圈(圖1)。該結果說明NCD-2菌株培養(yǎng)液中含有對棉花黃萎病病原菌有強抑制作用的物質(zhì),屬于NCD-2菌株的胞外分泌物質(zhì)。2.2培養(yǎng)條件對2號c-2菌的抗菌活性的影響2.2.1培養(yǎng)液的抑菌圈采用不同的培養(yǎng)基對菌株NCD-2進行培養(yǎng),試驗結果表明,在應用不同培養(yǎng)基對NCD-2菌株培養(yǎng)時,其培養(yǎng)液的抑菌圈的大小不同。其中NB培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基時,NCD-2菌株培養(yǎng)液的抑菌作用最強,抑菌圈直徑達到19.5mm,明顯大于其他4種培養(yǎng)液的抑菌作用(圖2)。該結果說明了NB培養(yǎng)液適宜NCD-2菌株產(chǎn)生胞外抗菌物質(zhì)。2.2.2培養(yǎng)溫度對雙乳酸酯抑菌圈直徑的影響在3種不同溫度(25,30,37℃)下對NCD-2菌株進行培養(yǎng)。試驗結果表明,培養(yǎng)溫度為30℃時,其培養(yǎng)液的抑菌作用最強,抑菌圈直徑達到19.5mm,明顯大于其他兩溫度培養(yǎng)下培養(yǎng)液的抑菌作用(圖3)。該結果說明30℃培養(yǎng)適宜NCD-2菌株產(chǎn)生胞外抗菌物質(zhì)。2.2.3培養(yǎng)條件的影響使用5種初始pH值(3.0,5.0,7.0,9.0,11.0)的NB培養(yǎng)基對NCD-2菌株進行培養(yǎng)。試驗結果表明培養(yǎng)液初始pH為7.0時,培養(yǎng)液的抑菌作用最強,抑菌圈直徑達到19.0mm,明顯大于其他pH培養(yǎng)液的抑菌作用(圖4)。該結果說明培養(yǎng)液初始pH為7.0時適宜NCD-2菌株產(chǎn)生胞外抗菌物質(zhì)。2.2.4培養(yǎng)2d前后抑菌圈直徑的變化試驗結果表明,NCD-2菌株經(jīng)不同的培養(yǎng)時間(1,2,3,4,5和6d)培養(yǎng)后,其培養(yǎng)液抑菌活性在培養(yǎng)2d時抑菌圈直徑達到最大,3d以后抑菌圈直徑大小略有下降,并趨于穩(wěn)定(圖5)。該結果說明培養(yǎng)2d適宜NCD-2菌株產(chǎn)生胞外抗菌物質(zhì),過短或過長都不能達到最佳的效果。2.3抑菌活性測定對菌株NCD-2的培養(yǎng)液進行蛋白類物質(zhì)的提取和抑菌活性測定,試驗結果表明,供試樣品周圍出現(xiàn)大而清晰的抑菌圈(圖6)。該結果說明經(jīng)硫酸銨鹽析提取的蛋白粗提液對棉花黃萎病病原菌有明顯的抑菌作用。2.4硫酸銨分級沉淀蛋白的抑菌活性采用不同飽和度的硫酸銨對菌株NCD-2的無菌培養(yǎng)液進行沉淀,試驗結果表明,培養(yǎng)液經(jīng)30%～80%飽和度硫酸銨沉淀的蛋白粗提液均有抑菌活性,而硫酸銨飽和度大于80%或小于30%時,其沉淀的蛋白粗提液沒有抑菌活性(表1)。因此在以后的試驗中采用80%飽和度硫酸銨進行鹽析:先在無菌體培養(yǎng)液中加入30%飽和度的硫酸銨,4℃沉淀過夜,離心去沉淀,上清液中補加硫酸銨至80%飽和度,4℃沉淀過夜沉淀出大部分抗菌蛋白。2.5k、胰蛋白酶對k-k-pb基因回復突變菌圈直徑的影響,k、胰蛋白酶控制抑菌活性試驗結果表明NCD-2菌株粗蛋白提取液經(jīng)不同的酶處理后,經(jīng)RNaseI處理后抑菌活性基本不變,經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶處理后抑菌圈直徑與對照相比差異顯著(p=0.05),處理后提取液的抑菌活性分別為未經(jīng)處理的提取液抑菌活性的55%和54%(圖7)。該結果說明NCD-2菌株抗菌粗蛋白提取液中抗菌物質(zhì)為混合成分,其中含有一部分蛋白類物質(zhì)。2.6粗蛋白抑菌活性與對照抑菌活性的比較試驗結果表明,NCD-2菌株粗蛋白經(jīng)60,80,100和120℃分別處理30min后,其抗菌活性隨著溫度的升高而降低,經(jīng)60℃處理的粗蛋白抑菌活性與對照相比差異不顯著,經(jīng)80,100℃處理的粗蛋白抑菌活性與對照相比差異顯著,且經(jīng)120℃處理后的抑菌活性與對照相比差異較顯著(p=0.05),但仍有部分抗菌活性,為對照的59.4%(圖8)。該結果說明,NCD-2菌株粗蛋白中抗菌成分可能是一種混合成分,部分抗菌成分屬于耐熱物質(zhì)。3枯草芽孢桿菌抗菌、肽類抗菌物質(zhì)枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì),包括肽類、蛋白類、氨基多糖類和多烯類物質(zhì),其中尤以肽類抗菌物質(zhì)研究的最多。細菌培養(yǎng)液經(jīng)硫酸銨沉淀、鹽析后可以得到蛋白或多肽類物質(zhì),其中肽類抗菌物質(zhì)一般表現(xiàn)為熱穩(wěn)定性和對蛋白酶不敏感性。目前對枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的研究報道很多,如謝棟等研究的枯草芽孢桿菌BS-98抗菌蛋白,該抗菌蛋白經(jīng)蛋白酶K處理后部分活性喪失,經(jīng)120℃處理后仍保持54%的抑菌活性;啟東梅等研究的芽孢桿菌抗菌蛋白,該抗菌蛋白對蛋白酶不敏感,120℃熱處理后活性全部喪失;汪澈等研究的枯草芽孢桿菌B9601-Y2抗菌蛋白,該抗菌蛋白對蛋白酶部分敏感,120℃熱處理后活性全部喪失;孫瑤等研究的枯草芽孢桿菌BDT-25抗菌蛋白,該抗菌蛋白對蛋白酶K敏感