第九章分子生物學(xué)研究方法(2)1分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)第四節(jié) DNA重組技術(shù)一、目的DNA片段的獲得二、載體（質(zhì)粒、噬菌體、cos質(zhì)粒、病毒）三、DNA酶切四、DNA的連接和轉(zhuǎn)化五、重組質(zhì)粒的篩選和鑒定1.質(zhì)粒DNA的提取2.質(zhì)粒DNA的純化3.重組質(zhì)粒的篩選和鑒定分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)DNA重組

DNA重組是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復(fù)制的載體DNA連接，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程。又稱DNA克隆、分子克隆、基因操作。3分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)重組DNA技術(shù)史上的主要事件1967年第一次發(fā)現(xiàn)DNA連接酶1970年分離了第一種限制性內(nèi)切核酸酶，發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶1972年獲得第一個重組DNA分子1973年完成第一例細菌克隆1975-1977年發(fā)明了DNA序列測定技術(shù)，1977年完成了全長5387bp噬菌體f174基因組測定1978年首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素1981年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因果蠅1983年獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物1986年GMO首次在環(huán)境中釋放1994年第一批基因工程西紅柿在美國上市2000年完成第一個高等植物擬南芥的全序列測定(1.2X108bp)2001年完成第一個人類基因組全序列測定(2.7X109bp)2005年中、美、日科學(xué)家聯(lián)合完成水稻基因組全序列測定分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)第一個DNA重組子（PaulBerg,1972）EcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA5分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)DNA重組的一般步驟1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。6分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。4.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經(jīng)得到擴增的目的基因。7分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)酶

類功

能限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進行末端標記實驗或用來進行DNA的連接末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團重組DNA實驗中常見的主要工具酶分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)

生物基因組DNA

細胞mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈cDNA

通過機械切割、核酸限制性內(nèi)切酶消化等處理成適合克隆的DNA小片段通過PCR技術(shù)可以獲得目的基因人工化學(xué)直接合成一、目的DNA片段的獲得10分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（一）特點

基因工程載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進入適當宿主細胞自主復(fù)制的DNA分子。二、載體在宿主細胞中有獨立的復(fù)制和表達的能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴增。分子量盡可能小，多拷貝、松馳控制型。能插入較大的外源DNA片段。載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性標記基因），以賦予宿主細胞的不同表型特征（如對抗生素的抗性）。載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點是位于檢測表型的標記基因之內(nèi)可造成插入失活效應(yīng)，則更有利于重組子的篩選。分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)多克隆位點lacZ’載體名稱載體大小選擇性標記基因多克隆位點(multiplecloningsites，MCS)指多個限制性內(nèi)切酶的單一切點。由許多限制酶切位點組成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。12分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（二）類型從總體上講，根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為：

克隆載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。DNA克隆常用的載體有：

質(zhì)粒載體（plasmid），如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等；噬菌體載體（phage）；柯斯質(zhì)粒載體（cosmid）；單鏈DNA噬菌體載體（ssDNAphage）；噬粒載體（phagemid）；酵母人工染色體（YAC）；細菌染色體克隆載體（BAC）等。13分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)1.質(zhì)粒載體是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點:①分子量小，穩(wěn)定存在，較高拷貝數(shù)；②遺傳標志；③內(nèi)切酶點。14分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（1）pBR322質(zhì)粒載體123來源于pSF2124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tertr）來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點（ori）15分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（2）pUC質(zhì)粒載體氨芐青霉素抗性基因(ampr)大腸桿菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列位于lacZ基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(MCS)區(qū)段，它并不破壞該基因的功能。來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點（ori）16分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（3）pMD19-T質(zhì)粒17分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)2.噬菌體載體

（1）噬菌體的生物學(xué)特性

溶菌周期指噬菌體將DNA注入寄主細胞后很快環(huán)化，然后進行自我復(fù)制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。(烈性噬菌體只具有溶菌生長周期)

溶源周期中，注入寄主細胞的噬菌體DNA是整合到寄主細胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復(fù)制。(溫和噬菌體具有溶源生長周期和溶菌生長周期)18分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（2）λ噬菌體A.生物學(xué)特性

組成：蛋白質(zhì)外殼和線狀雙鏈DNA分子組成。

DNA長度為48502bp，在分子兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端。當其注入到寄主細胞中后，可以迅速通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環(huán)形DNA分子。上述通過粘性末端互補形成的雙鏈區(qū)被稱為cos位點（cohesiveendsite）。19分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)

溫和噬菌體一般以溶源生長進行增殖，脅迫條件下也會進入溶菌生長周期。

復(fù)制溶源周期隨溶源細菌染色體一起復(fù)制;

溶菌周期的早期是“θ”復(fù)制，晚期進行滾環(huán)復(fù)制

基因組成

DNA至少包括61個基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因，另一部分約1／3為非必須區(qū)段。

20分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)B.類型插入型（Insertionvectors）這種載體僅僅有一個可供外源DNA插入的克隆位點。如：λgt10、λgt11

克隆能力小，不到10kb置換型（Replacementvectors）這種載體具有兩個對應(yīng)的酶切克隆位點，在兩個位點之間的λDNA區(qū)段是λ噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如：Charon4載體克隆能力大，20～25kb21分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（3）M13噬茵體單鏈閉合環(huán)狀噬菌體只能感染雄性細菌，外形成絲狀，基因組DNA長約6.4kb，可分為10個區(qū)和507bp基因間隔區(qū)（IS區(qū)），該區(qū)可以接受外源DNA的插入而不會影響到噬菌體的活力。這是該噬菌體能用作單鏈DNA載體的重要前提。22分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)復(fù)制與增殖M13(+)鏈DNA進入細胞內(nèi)部合成出互補的(-)鏈DNA,此雙鏈形式的M13DNA，稱為復(fù)制型DNA。按θ形式進行幾輪復(fù)制之后，基因Ⅱ的產(chǎn)物便在RFDNA的正鏈特定位點上作切割反應(yīng)，形成一個缺口。M13基因組利用大腸桿菌的DNA聚合酶I，以環(huán)形的MI3(-)DNA為模板合成M13(+)DNA。當DNA復(fù)制叉沿著模板DNA分子轉(zhuǎn)移到復(fù)制終點時，在基因Ⅱ編碼產(chǎn)物的作用下，新合成的(+)DNA便會被切除下去，并進一步環(huán)化形成單位長度的M13基因組DNA。23分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)3、柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒(cosmid)又稱粘粒，“cosmid”一詞是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點的質(zhì)粒。所謂柯斯質(zhì)粒其實是一類由人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，具有與質(zhì)粒相同的結(jié)構(gòu)特點，為雙鏈、環(huán)狀DNA。24分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)柯斯質(zhì)粒具有下列特點：①具有質(zhì)粒載體的特性。②帶有λ噬菌體的粘性末端(cos區(qū))。③一個或多個酶切位點。④具有高容量的克隆能力。⑤非重組體粘性質(zhì)粒很小，不能在體外包裝，因而有利于重組體的篩選。25分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)類型：（1）重組型病毒載體

（2）無病毒基因的病毒載體——復(fù)制缺陷型可復(fù)制型復(fù)制缺陷型4.病毒載體組成：（1）病毒復(fù)制和包裝元件 （2）病毒基因 （3）插入的外源基因或元件 （4）病毒外殼/外膜26分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)優(yōu)點：（1）利用病毒天然的感染性進入細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高； （2）復(fù)雜的裝配過程由細胞完成； （3）不同的病毒載體具有不同的表達特點。27分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)常用的病毒載體的特點：病毒載體生物學(xué)特性適用范圍反轉(zhuǎn)錄病毒載體

單鏈RNA病毒

8~10kb可感染分裂細胞；整合到染色體中；表達時間較長；有致癌的危險；Exvivo基因治療；腫瘤基因治療。腺病毒載體

雙鏈DNA病毒

36kb可感染分裂和非分裂細胞；不整合到染色體中；外源基因表達水平高；表達時間較短；免疫原性強；Invivo基因治療；腫瘤基因治療；疫苗。AAV病毒載體

單鏈DNA病毒

~5kb可感染分裂和非分裂細胞；整合到染色體中；無致病性；免疫原性弱；可長期表達外源基因；在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中表達較高；Invivo基因治療；Exvivo基因治療；遺傳病基因治療；獲得性慢性疾病的基因治療。HSV病毒載體

雙鏈DNA病毒

152kb具有嗜神經(jīng)性；可逆軸突傳遞；可潛伏感染；容量大；可感染分裂和非分裂細胞；神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療；腫瘤的基因治療。分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)

根據(jù)限制酶的識別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。

Ⅰ類和Ⅲ類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴ATP的限制性內(nèi)切酶活性。

Ⅰ類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識別位點，且沒有特定的切割位點，酶對其識別位點進行隨機切割，很難形成穩(wěn)定的特異性切割末端。

Ⅲ類限制性內(nèi)切酶在識別位點上切割，然后從底物上解離下來。故Ⅰ類和Ⅲ類酶在基因工程中基本不用。1.限制酶的類型三、DNA酶切29分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)Ⅱ型酶Ⅱ型酶就是通常指的DNA限制性內(nèi)切酶.

它們能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個順序內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異的DNA片段；

Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識別順序一般為４～６個堿基對的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序；

Ⅱ型內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生３種不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)DNA進行改造，從而極大地推動了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。30分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)同尾酶(Isocaudamer)

能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶，一般是指能產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。具有不同識別序列的限制性內(nèi)切酶,切割DNA分子后產(chǎn)生相同的粘性末端。例如：SalI與XhoI,BamHI與BglⅡ。所有平末端酶產(chǎn)生的末端均是相同的，但一般不把它作為同尾酶來研究。同裂酶(Isoschizomers)

來源于不同物種但能識別相同DNA序列的限制性內(nèi)切酶，切割位點可以相同也可以不同。比如Sma1和Xma1，它們均識別CCCGGG，但前者切后產(chǎn)生平末端，后者切后產(chǎn)生粘性末端。32分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（一）DNA的連接

1.DNA連接酶通過合成相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而修復(fù)缺口或催化粘合完全分離的兩個DNA片段。eg:T4DNAligaseT4DNA連接酶（需要ATP作為輔助因子）主要用于：（1）連接具有同源互補粘性末端的ＤＮＡ片段；（2）雙鏈DNA分子間的平端；（3）在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。四、DNA的連接和轉(zhuǎn)化33分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)2.粘性末端連接連接后可能出現(xiàn)以下問題：（1）載體自身環(huán)化，造成假陽性背景克隆，為避免此問題，可在連接前，用堿性磷酸酶將載體DNA5’-端去磷酸化，這樣只有載體和插入片段之間才能發(fā)生連接；（2）插入片段可雙向插入；（3）插入片段可多拷貝插入。34分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)3.平端連接平端連接的優(yōu)點是可用T4連接酶連接任何DNA平端，這對不同DNA分子的連接十分有利。平端連接的主要問題是，它的連接效率比粘性末端低，因此需較多的T4DNA連接酶和較高的底物濃度，聚乙二醇（PEG）可促進平端連接反應(yīng)。4.人工接頭連接5.利用適配子連接35分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（二）重組DNA的轉(zhuǎn)化

1.轉(zhuǎn)化（transformation）指以細菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細胞的過程。接受轉(zhuǎn)化DNA的菌株稱為受體菌株。轉(zhuǎn)化時，細菌必須經(jīng)過適當?shù)奶幚恚ㄈ珉姄舴?，CaCl2，RbCl(KCl)等化學(xué)試劑），使之處于感受態(tài)

—即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細菌宿主中。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-，M-)，它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。36分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)常用的大腸桿菌菌株：

DH5aJM109TOP10常用的農(nóng)桿菌菌株：

EHA105LAB440437分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（1）將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。步驟：（2）與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細胞表面的復(fù)合物。（3）立即將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會被細胞所吸收。38分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)（5）涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。（4）在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達、細胞活性恢復(fù)分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)2.轉(zhuǎn)染和感染感染：在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。轉(zhuǎn)染：在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。40分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)五、重組質(zhì)粒的篩選和鑒定（一）質(zhì)粒DNA的提取1.細菌的收獲含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)→移至1.5ml離心管→離心沉淀細胞2.細菌的裂解（1）堿裂解法（2）煮沸法

從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽性克隆的過程就是篩選。41分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)

堿裂解法提取質(zhì)粒DNA

根據(jù)Birnboim和Doly（1979）以及Ish-Horowicz和Burke（1981）的方法修訂而成的應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法之一。優(yōu)點：收獲率高，適于多數(shù)的菌株，所得產(chǎn)物經(jīng)純化后可滿足多數(shù)的DNA重組操作。

基本原理：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。用酒精沉淀法可以收集仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒DNA。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。42分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)

純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學(xué)實驗室中常用。（二）質(zhì)粒DNA的純化43分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)上清液加入固體CsCl與EtBr溶液室溫下超速離心(45,000rpm）16小時穿孔取出DNA（320nm）異丙醇抽提溴乙錠緩沖液透析除去殘余CsCl兩倍體積冷乙醇沉淀DNA離心、洗滌、干燥氯化銫密度梯度離心法實驗表明，在細胞裂解及DNA分離的過程中，大分子量的細菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應(yīng)的線性片段，而質(zhì)粒DNA則由于其分子量較小、結(jié)構(gòu)緊密，因此仍能保持完整的狀態(tài)。這種差別對質(zhì)粒DNA的純化是十分有用的。44分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)缺點

通過氯化銫-EtBr密度梯度離心法雖然可以得到高純度、高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，但它操作復(fù)雜，需要價格昂貴的氯化銫和超速離心機設(shè)備，而且溴化乙錠又是一種致癌物質(zhì)，如果操作不慎，不僅會造成環(huán)境污染，還會危及實驗工作人員的身心健康。45分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)1.抗藥性標志的篩選2.β－半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選–藍白斑篩選（三）重組質(zhì)粒的篩選和鑒定

現(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體(如pUC系列、pBluescript、pGem和它們的衍生載體)都帶有一個大腸桿菌DNA的短片段，其中含有β-半乳糖苷酶前146個氨基酸的編碼信息及調(diào)控序列。在各自獨立的情況下，pBS(pUC、pGem等)和DH5a編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5a融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補的現(xiàn)象叫α-互補。46分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)Lac+細菌，在生色底物X-gal的存在下被IPTG誘導(dǎo)形成藍色菌落。帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性，顯白色菌落。分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)3.菌落快速裂解鑒定法菌落裂解后去除蛋白，直接凝膠電泳檢測4.通過聚合酶鏈反應(yīng)篩選重組子123456空白PDs5′基因特異引物48分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)5.內(nèi)切酶圖譜鑒定6.菌落或噬菌斑原位雜交BamHⅠ/PstI1234

制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。

目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段，或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。49分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)第五節(jié) 基因分離技術(shù)一、克隆的概念二、克隆基因的分離1.應(yīng)用核酸探針2.應(yīng)用mRNA差別顯示3.應(yīng)用cDNA差示分析4.應(yīng)用酵母雙雜交體系5.基因的圖位克隆法6.Microarray(教材p.182-187)50分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)一、克隆的概念克隆可以理解為復(fù)制、拷貝，就是從原型中產(chǎn)生出同樣的復(fù)制品，它的外表及遺傳基因與原型完全相同。51分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)分子水平：DNA克隆，也叫分子克隆。含義是將某一特定DNA片斷通過重組DNA技術(shù)插入到一個載體(如質(zhì)粒和病毒等)中，然后在宿主細胞中進行自我復(fù)制所得到的大量完全相同的該DNA片斷的“群體”。細胞水平：指由同一個祖細胞（progenitorcell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。個體水平：指基因型完全相同的兩個或更多的個體組成的一個群體。如：從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)1.應(yīng)用核酸探針分離克隆目的基因二、克隆基因的分離

把基因文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，就可以與特異性的核酸探針進行菌落或噬菌班雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆。這個過程叫做克隆基因的分離或篩選。

應(yīng)用核酸探針分離目的基因的方法叫做核酸雜交篩選法。此法應(yīng)用廣泛，相當有效，尤其適用于大規(guī)模篩選。分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)2.應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)(DDRT-PCR)分離克隆目的基因

在生物個體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細胞中發(fā)生的不同基因按時間、空間進行有序的表達方式，叫做基因的差別表達（differentialexpression）。54分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)3、應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因

這種方法能夠充分發(fā)揮PCR技術(shù)以指數(shù)形式擴增雙鏈DNA模板的性質(zhì)，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法特異性擴增目的基因片段。因為試驗對象（tester）和供試探針（driver）在接受差示分析前均經(jīng)過一個4堿基切割酶的處理，形成平均長度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息被擴增。每次t減d反應(yīng)后僅設(shè)置72℃復(fù)性與延伸，94℃復(fù)性這兩個參數(shù)共20個PCR循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。56分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)57分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)4、應(yīng)用酵母雙雜交體系克隆基因5、基因的圖位克隆法58分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)6、DNA的Microarray59分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)InfectedIBLUninfectedIBL60分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)第六節(jié) 分子雜交技術(shù)一、Southern印跡雜交(DNA)二、Northern印跡雜交（RNA）三、斑點雜交（dotblotting）四、Western印跡雜交（Protein）五、原位雜交六、基因芯片七、酵母雜交技術(shù)61分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)雜交(hybridization)：兩條來源不同的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們有大致相同的互補堿基順序，經(jīng)退火處理即可復(fù)性，形成新的雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為核酸的分子雜交。（注意與復(fù)性的區(qū)別）核酸雜交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA雜交。62分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)

在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”上去的，因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交”。

分子雜交是目前分子生物學(xué)最廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。利用此技術(shù)，可以求出特定基因的頻率、基因組織的特點、基因結(jié)構(gòu)和定位、基因表達等。電泳凝膠核酸印跡法斑點和狹線印跡法菌落和噬菌斑印跡法63分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)E.M.Southern于1975年首先設(shè)計出來的。材料： 尼龍濾膜 硝酸纖維素濾膜 二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）步驟：第一：將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上－核酸印跡轉(zhuǎn)移第二，是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標記的DNA探針進行雜交一、Southern印跡雜交(DNA)

64分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)SouthernBlotting的過程1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過電泳液的移動轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固定膠中的DNA到膜上4.預(yù)雜交和雜交（放射性和熒光檢測）5.結(jié)果檢測分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)M1210×SSC轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500g12與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內(nèi)切酶NC或尼龍膜NC膜或尼龍膜分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)

將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。二、Northern印跡雜交（RNA）67分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)68分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)三、斑點雜交（dotblotting）69分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)四、Western印跡雜交（Protein）70分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)Step2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopmentStep1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigen分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)72分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)

組織原位雜交簡稱原位雜交（insituhybridization），是在細胞保持基本形態(tài)的情況下將探針注入細胞內(nèi)與RNA或DNA雜交，雜交反應(yīng)在載物片上的細胞內(nèi)進行。

基本步驟是通過適當處理使細胞滲透性增加，探針進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交、沖洗等。用放射自顯影或免疫酶法或熒光顯示雜交結(jié)果。五、原位雜交（教材P175）73分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)LocalizationofDNALocalizationofRNA74分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)熒光原位雜交(FlorescenceIn-SituHybridization,FISH)

一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術(shù)。FISH技術(shù)是將熒光基團標記特異性的DNA探針，再將標記了熒光信號的探針與待測樣本進行原位雜交，最后在熒光顯微鏡下對熒光信號進行辨別和計數(shù)。分子生物學(xué)導(dǎo)論-分子生物學(xué)研究方法(2)研究DNA分子水平上的多態(tài)性RFLP(rest