杠柳化學(xué)成分研究

柳樹是羅西亞科的一種藤蔓灌木，也被稱為柳樹科、柳樹科和柳樹科。主要分布在吉林、遼寧、河北、山西、陜西等北方地區(qū),資源豐富。杠柳曾是我國(guó)民間使用的土農(nóng)藥,其根皮粉對(duì)白菜葉甲(Colaphellusbowringi)有一定的胃毒活性,對(duì)二十八星瓢蟲(Epilachna28-maculate)具有胃毒和驅(qū)避作用,可毒殺豆蚜(Aphiscraccioora),杠柳的提取物對(duì)小菜蛾(Plutellaxylostella)幼蟲有拒食和毒殺作用。杠柳中的化學(xué)成分主要有:杠柳毒甙、北五加皮甙、孕烯酮類、寡糖、4-甲氧基水楊醛、β-谷甾醇等。為了更好的利用杠柳這一寶貴殺蟲植物,筆者在殺蟲活性追蹤指導(dǎo)下對(duì)杠柳根部殺蟲活性成分進(jìn)行研究,分離得到殺蟲活性化合物L(fēng)Y01,LY01的結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR鑒定為杠柳新甙A(PeriplocosidesA),即北五加皮甙A。1材料和方法1.1試驗(yàn)動(dòng)物與儀器杠柳(PeriplocasepiumBunge)根部由延安市藥材公司提供,自然陰干備用。供試?yán)ハx為人工累代飼養(yǎng)的粘蟲(Mythimnaseparata)3齡、6齡幼蟲,由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥研究所養(yǎng)蟲室提供。儀器與試劑:熔點(diǎn)使用X-4數(shù)字顯微熔點(diǎn)儀測(cè)定(溫度計(jì)未經(jīng)校正),核磁共振譜使用BrukerAM-400核磁共振儀測(cè)定,CDCl3作溶劑,TMS作內(nèi)標(biāo)。硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品,其它溶劑未加特殊說明者均為市售分析純。比旋光度由Perkin-Elmer241MC型自動(dòng)旋光儀測(cè)定,CH3Cl為溶劑,20℃,589nm,高效液相色譜儀為日本島津LC-6AD高效液相色譜儀。1.2方法1.2.1小麥葉片的處理采用浸葉飼蟲法。將供試樣品配成所需濃度的丙酮溶液,將0.5cm×0.5cm小麥葉片在藥液中浸漬2s,對(duì)照在丙酮溶液中浸漬2s,待溶劑揮發(fā)后,將葉碟放入培養(yǎng)皿中,接1頭饑餓12h的3齡幼蟲,每樣處理10頭試蟲,重復(fù)3次。24h、48h后檢查結(jié)果,取平均值,計(jì)算死亡率和校正死亡率。1.2.2100死亡率(%)=(死亡蟲數(shù)/供試蟲數(shù))×100;校正死亡率(%)=[(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)]×100。1.2.3試蟲的處理將P-3樣品配成5.0mg·mL-1的丙酮溶液,將0.5cm×0.5cm小麥苗葉片在藥液中浸漬2s,對(duì)照在丙酮溶液中浸漬2s,待溶劑揮發(fā)后,將葉碟放入培養(yǎng)皿中,接1頭饑餓12h的6齡幼蟲,處理30頭試蟲,對(duì)照處理10頭。4h、12h、24h后分別將出現(xiàn)癥狀的試蟲及對(duì)照試蟲用波因固定液(苦味酸∶甲醛=75∶25)固定,24h后解剖試蟲。1.2.4昆蟲活性測(cè)定將粉碎后的杠柳樣品2.5kg用9000mL甲醇加熱回流提取3h,過濾,濾渣重復(fù)用9000mL甲醇提取2次,合并提取液,回收溶劑后得浸膏353.0g。取部分樣品進(jìn)行殺蟲活性測(cè)定。將352.0g浸膏加1200mL水懸浮,用1000mL氯仿萃取,重復(fù)3次?；厥章确潞蟮玫铰确螺腿∥?2.5g,濃縮水相部分共得到120.7g。取部分樣品進(jìn)行殺蟲活性測(cè)定。1.2.5化合物lya1135一級(jí)柱層析:稱取90.0g氯仿萃取物,硅膠(100～200目)柱層析(80mm×1200mm),石油醚∶乙酸乙酯=10∶0～5∶5(V/V)梯度洗脫,每500mL收集1份。TLC檢測(cè),得到F-1、F-2、F-3、……,F-10洗脫物。殺蟲活性測(cè)定后,活性段進(jìn)行下一步柱層析分離。二級(jí)柱層析:稱取30.0gF-9,硅膠(200～300目)柱層析(30mm×600mm),用石油醚∶乙酸乙酯∶丙酮=1∶2∶3(V/V)的混合液淋洗,每100mL接收1份。TLC檢測(cè),得到7份:P-1、P-2、……,P-7洗脫物。殺蟲活性測(cè)定后,活性段進(jìn)行下一步分離。制備高效液相純化:稱取200.0mgP-3,用2mL氯仿溶解,進(jìn)行高效液相色譜分離。得到化合物L(fēng)Y01(10.3mg)。進(jìn)行殺蟲活性測(cè)定。色譜條件:ShimadzuLC-6AD,具SPD-M10A二極管陣列檢測(cè)器;HypersilODS2色譜柱(20×250mm,10μm);流動(dòng)相:甲醇∶水=8∶2(V/V);流速3.0mL/min;柱溫25℃;波長(zhǎng)280nm;進(jìn)樣量200μL(濃度100mg·mL-1)。2結(jié)果與分析2.1部分試蟲已感染時(shí)死亡試蟲的癥狀杠柳根部的甲醇提取物及氯仿萃取物作用于試蟲10h后,部分試蟲出現(xiàn)中毒癥狀,隨后,這些試蟲在24h、48h后死亡。從表1中可以看出杠柳的甲醇提取物對(duì)粘蟲有胃毒活性,氯仿萃取后活性增強(qiáng),水相部分沒有活性。2.2試蟲的死亡時(shí)間一級(jí)柱層析各流分作用于試蟲6h后,部分試蟲出現(xiàn)中毒癥狀,隨后,這些試蟲在24h、48h后死亡。從表2可以看出F-7～F-10均有明顯的殺蟲活性,其中F-9殺蟲活性最強(qiáng),在5mg·mL-1濃度下,處理后24h死亡率即達(dá)到100%。2.3蟲在24h、48h后死亡二級(jí)柱層析各餾分作用于試蟲4h后,部分試蟲出現(xiàn)中毒癥狀,隨后,這些試蟲在24h、48h后死亡。從表3中可以看出除P-1外,其它6個(gè)流分都有一定的殺蟲活性,其中P-3殺蟲活性最強(qiáng),在5mg·mL-1濃度下,處理后24h、48h校正死亡率分別為83.33%和96.67%。2.4試蟲的死亡試驗(yàn)高效液相色譜分離的化合物L(fēng)Y01作用于試蟲4h后,部分試蟲出現(xiàn)中毒癥狀。隨后,這些試蟲在24h、48h后死亡。從表4可以看出LY01是杠柳主要?dú)⑾x活性物質(zhì)。2.5腸道結(jié)構(gòu)及肉樣的變化杠柳活性部分對(duì)粘蟲作用后表現(xiàn)出特殊癥狀。經(jīng)P-3樣品浸葉飼喂法處理4h后,試蟲被擊倒,出現(xiàn)中毒癥狀。從圖1A可以看出正常粘蟲蟲體粗細(xì)均勻,蟲體可自由彎曲。圖1B～E為中毒試蟲,中毒后試蟲明顯腹部腫脹,不能彎曲亦不能爬行,但身體上部及頭部可自由活動(dòng)。圖1D為癥狀出現(xiàn)初期,其腹足可正常伸縮,隨著中毒時(shí)間延長(zhǎng),腹足不能正常伸縮,但用針刺激仍有反應(yīng)。最終因腫脹加劇,試蟲24h后死亡。解剖鏡下觀察試蟲消化道及脂肪體,可見對(duì)照試蟲消化道結(jié)構(gòu)完整,輪廓清晰,中腸粗細(xì)均勻,中腸外圍環(huán)肌排列整齊,消化道周圍包繞的脂肪體呈明顯的片狀結(jié)構(gòu)(圖2的對(duì)照)。處理4h后,蟲體中腸腫大,中腸腸壁變薄(圖2的4h后);12h后,中腸腸壁破裂,腸道內(nèi)容物外溢到體腔(圖2的12h后)。死亡后的試蟲,整個(gè)中腸及脂肪體被破壞殆盡(圖2死亡)。推測(cè)可能是杠柳殺蟲活性成分破壞了粘蟲中腸細(xì)胞,致使血淋巴穿過腸壁細(xì)胞進(jìn)入中腸,導(dǎo)致中腸腫脹,隨著進(jìn)入中腸的血液增多,腸壁破裂,中腸解體,試蟲死亡。這種癥狀表現(xiàn)說明杠柳新苷A可能為昆蟲消化毒劑。2.6糖苷的糖鏈和分子身份證的建立LY-01:白色粉末,m.p171-174℃(文獻(xiàn)值;174～176℃);比旋光度[α]D20=-3.6°(C=1.21CHCl3){文獻(xiàn)值;[α]D20=-1.2°(C=1.4CHCl3)}。13CNMR譜給出72個(gè)碳信號(hào),結(jié)合DEPT譜可以看到LY-01含有8個(gè)季碳,33個(gè)CH,14個(gè)CH2,17個(gè)CH3。并且明顯地看出169.4和185.8為2個(gè)羰基季碳的信號(hào),147.8和140.3為2個(gè)雙鍵上的季碳,121.9和118.4為2個(gè)雙鍵上的CH,54.9,57.5,57.9,58.0,58.8,57.4為6個(gè)OMe的碳信號(hào),在糖區(qū)表現(xiàn)典型的糖苷特征,98.4,99.3,99.6,100.3,102.4,113.7,76.98,77.35,77.60,77.64,78.33,79.24,68.09,68.15,68.47,68.89,69.84,70.02,70.42,70.99,81.62,82.54,82.54,82.65,86.3,顯示多個(gè)糖上的碳信號(hào),并且102.4,100.3,99.6,99.3,98.4,5個(gè)CH信號(hào),86.3CH2,113.7季碳,表明形成糖苷的糖鏈由6個(gè)單糖組成,5個(gè)醛糖,1個(gè)酮糖。由1HNMR可以清楚看到3.40附近多個(gè)OMe中的質(zhì)子信號(hào),0.72,0.99兩個(gè)連在季碳上的甲基,2.10一個(gè)乙酰基上的甲基。4.38,4.58,4.74,4.764.92,5.14顯示多個(gè)糖異頭炭上的質(zhì)子信號(hào)。結(jié)合13CNMR和1HNMR譜,與文獻(xiàn)報(bào)道的C72H114O27杠柳新苷A基本一致,故活性化合物L(fēng)Y01鑒定為杠柳新苷A。.13CNMR譜具體歸屬如下:甾體苷元:38.4(C-1),29.3(C-2),78.6(C-3),38.3(C-4),140.3(C-5),121.9(C-6),30.9(C-7),31.9(C-8),49.6(C-9),36.9(C-10),20.5(C-11),37.3(C-12),45.3(C-13),51.1(C-14),23.3(C-15),30.9(C-16),85.4(C-17),14.1(C-18),19.3(C-19),83.1(C-20),17.5(C-21),97.1(C-1′),185.8(C-2′),147.8(C-3′),118.4(C-4′),68.8(C-5′),22.9(C-6′),54.9(OMe)。糖鏈:Canaros:100.3(C-1),38.4(C-2),76.98(C-3),79.24(C-4),70.02(C-5),17.0(C-6);Heptulose86.3(C-1),113.7(C-2),36.9,(C-3),78.33(C-4),82.65(C-5),69.84(C-6),17.9(C-7);Cymarose1:98.4(C-1),36.8(C-2),77.64(C-3),82.54(C-4),68.89(C-5),18.2(C-6);Cymarose2:99.3(C-1),36.5(C-2),77.60(C-3),82.54(C-4),68.47(C-5),17.9(C-6);Cymarose3:99.6(C-1),35.9(C-2),77.35(C-3),83.66(C-4),68.15(C-5),18.2(C-6);Digitalose:102.4(C-1),70.99(C-2),81.62(C-3),68.09(C-4),70.42(C-5),16.4(C-6)。57.5,57.9,58.0,58.8,57.4分別為Cymarose,Digitalose,Heptulose上的OMe,169.4,20.9分別為Dig