cyp27a1致散發(fā)性腦腱黃瘤1例

肝障瘤（ctx，om:213000）是一種常見的染色體隱性遺傳疾病，通過脂質(zhì)代謝障礙將導致各種組織和器官功能障礙。該疾病的主要臨床特征是肌腱黃瘤、障礙、腹瀉和骨質(zhì)疏松癥。此外，患者還可能出現(xiàn)精神障礙和神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的共濟失調(diào)癥狀。1991年,CYP27A1被確定為該病的致病基因。CYP27A1位于染色體2q35,包含9個外顯子,編碼固醇27-羥化酶。CYP27A1基因突變使固醇27-羥化酶活性減低或喪失,使體內(nèi)的膽固醇不能有效地代謝轉(zhuǎn)化為膽汁酸,引起膽固醇及膽甾烷醇在體內(nèi)多組織異常沉積,從而導致疾病的發(fā)生。本研究對1例腦腱黃瘤病患者進行CYP27A1突變檢測,以探討其分子發(fā)病機制,現(xiàn)報告如下。1對象和方法1.1x線片示試驗患者,女,21歲,廣州人,父母健康,為獨生女,生長發(fā)育過程基本正常,自幼智力稍低于同齡人,學習成績較差。14歲時發(fā)現(xiàn)雙側(cè)跟腱腫物伴跟腱增粗(圖1),無疼痛感,行走平穩(wěn),病理活檢顯示增生的纖維組織中見片巢狀黃瘤細胞、組織細胞和多核巨細胞,并可見膽固醇結(jié)晶裂隙,診斷為黃瘤病。15歲時行雙側(cè)先天性白內(nèi)障手術。行平路正常,但上下樓梯有不穩(wěn)感。體格檢查:神清,對答正常,反應稍慢。向右凝視可見粗大水平眼震,右手指鼻稍欠準,步態(tài)正常。雙側(cè)跟腱腫大,深部及兩側(cè)可捫及稍硬的腫塊,大小約11cm×4cm,無痛,踝關節(jié)活動度尚可。血總膽固醇5.73mmol/L,HDL1.65mmol/L,LDL3.66mmol/L。雙踝關節(jié)MRI:雙側(cè)跟腱自腓腸肌移行處至跟腱跟骨附著處明顯增粗,呈腫塊樣改變,右側(cè)為11.4cm×3.1cm×3.4cm,左側(cè)為11.0cm×3.0cm×3.1cm,T1WI呈均勻稍低信號,T2WI呈等、高混雜信號。頭顱MRI:T1WI示雙側(cè)小腦齒狀核對稱性不均勻稍低信號,邊界不清(圖2A),T2WI高信號(圖2B),FLARE稍高信號,無明顯水腫和強化,增強未見強化(圖2C)。腦部其余部位未見異常。X線片示雙側(cè)跟骨骨質(zhì)密度稍降低,腰椎骨密度低于同齡人。中國修訂韋氏成人智力量表檢查結(jié)果:言語量表47分,操作量表21分,總分68分;中國修訂韋氏成人記憶量表檢查結(jié)果:記憶商數(shù)78分。臨床確診為腦腱黃瘤病。1.2方法1.2.1樣品采集與dna提取1.2.2配合物pcr檢測從UCSC數(shù)據(jù)庫(http://ge-獲取CYP27A1基因的序列,利用Oligo6.0軟件自行設計9對PCR引物,并由深圳華大基因研究院合成,詳細引物序列見表1。第1外顯子PCR反應體系為:2×GCBufferⅠ15μL,2.5mmol/LdNTP混合物2.5μL,LATaqDNA聚合酶0.25μL,3.2μmol/L上下游引物各1μL,DNA模板2μL,滅菌ddH2O補足體積至30μL。對應反應條件為touch-downPCR:95℃預變性3min;95℃變性30s,68℃退火30s,72℃延伸45s,下1個循環(huán)的退火溫度依次降低1℃,共10個循環(huán);95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,共26個循環(huán);72℃10min。其余外顯子PCR反應體系為:10×擴增緩沖液3μL,25mmol/LMgCl23.5μL,2mmol/LdNTP混合物3μL,TaqDNA聚合酶1μL,3.2μmol/L上下游引物各1μL,DNA模板1μL,滅菌ddH2O補足體積至30μL。對應反應條件為:95℃預變性3min;95℃變性30s,表1所列引物特異性溫度退火45s,72℃延伸1min,45個循環(huán)后72℃10min。1.2.3搜索順序的確定2前3位t經(jīng)測序分析患者CYP27A1基因的9個外顯子及相應剪切位點序列,在第2內(nèi)含子檢測到1個剪切位點雜合突變c.446+1G>T;第5外顯子發(fā)現(xiàn)2個雜合錯義突變c.877A>T(p.Met293Leu)和c.1016C>T(p.Thr339Met)。剪切位點突變c.446+1G>T使第2內(nèi)含子的剪切供體GT改變?yōu)門T,錯義突變c.877A>T使293位密碼子由ATG改變?yōu)門TG,使編碼氨基酸由甲硫氨酸變?yōu)榱涟彼?通過檢索證實以上2個突變?yōu)閲鴥?nèi)外尚未報道的新突變,2個突變分別在105名(210個等位基因)無腦腱黃瘤病表型且無親緣關系的正常人中進行測序篩查,均未被檢出。而另一錯義突變c.1016C>T使339位密碼子由ACG改變?yōu)锳TG,使編碼氨基酸由蘇氨酸變?yōu)榧琢虬彼?該突變?yōu)閲鴥?nèi)外已報道的突變。對上述3個突變在患者父母中做測序檢測,證實患者從母親繼承突變c.446+1G>T和c.877A>T,從父親獲得突變c.1016C>T(圖3)。3cyp27a1基因突變膽固醇在體內(nèi)的主要代謝通路是在肝細胞中轉(zhuǎn)化為膽汁酸,CYP27A1基因編碼的固醇27-羥化酶催化由膽固醇合成膽汁酸的初始氧化反應。CYP27A1基因的突變使固醇27-羥化酶活性降低或喪失,膽固醇不能有效轉(zhuǎn)化為膽汁酸,過量的膽固醇和膽甾烷醇在體內(nèi)多個組織異常沉積,從而導致腦腱黃瘤病的發(fā)生。從突變類型來看,CYP27A1基因的突變主要為錯義突變和無義突變,其次為剪切位點突變、小片段的缺失和插入。固醇27-羥化酶屬于線粒體細胞色素P450家族的一員,長度為531個氨基酸,包含腎上腺皮質(zhì)鐵氧還原蛋白結(jié)合位點(adrenodoxin-bindingsite)和血紅素結(jié)合位點(heme-bindingsite)2個重要位點,這2個位點對于維持固醇27-羥化酶的活性具有重要作用,既往研究數(shù)據(jù)也表明,這2個位點所在區(qū)域為突變高發(fā)區(qū)域。本研究在1例21歲女性腦腱黃瘤病患者CYP27A1基因中發(fā)現(xiàn)1個剪切位點突變和2個錯義突變?；颊哌z傳自母親的剪切位點突變c.446+1G>T和錯義突變c.877A>T均為國內(nèi)外尚未報道的新突變。由于這2個突變均來自于母親,故它們位于同一條染色體上。CYP27A1基因第2內(nèi)含子剪切位點曾有c.446+1G>A的突變報道,但本研究發(fā)現(xiàn)的為c.446+1G>T,與已報道的不同,故為新突變。突變c.446+1G>T使第2內(nèi)含子剪切供體由GT改變?yōu)門T。該突變的發(fā)生將干擾第2外顯子與第3外顯子之間的正常剪切,故有可能使編碼肽鏈截斷,由于其出現(xiàn)在突變c.877A>T上游,故突變c.877A>T對患者而言可能并無實際意義。患者遺傳自父親的錯義突變c.1016C>T是目前已報道最常見的突變之一。在已研究的荷蘭人群中,幾乎2/3的患者被檢測到攜帶c.1016C>T突變,這一現(xiàn)象提示該突變在荷蘭可能存在建立者效應。在蛋白質(zhì)空間三級結(jié)構上,突變c.1016C>T可能由于空間位置緊鄰腎上腺皮質(zhì)鐵氧還原蛋白結(jié)合位點,影響該位點與腎上腺皮質(zhì)鐵氧還原蛋白的正確結(jié)合,從而降低固醇27-羥化酶的活性。由此可見,患者遺傳自父母的突變均可影響基因編碼產(chǎn)物固醇27-羥化酶的功能,阻礙體內(nèi)膽固醇的代謝,導致疾病的發(fā)生。腦腱黃瘤病典型的臨床癥狀大都要等成年以后才呈現(xiàn)出來,并且有些患者無跟腱黃瘤這一特征性臨床表現(xiàn),本例患者以跟腱黃瘤病起病,伴有白內(nèi)障和輕度的智力障礙(以操作智商損害明顯,語言和記憶商數(shù)損害不明顯),頭顱MRI提示小腦齒狀核異常信號,但共濟失調(diào)癥狀不明顯。從起病到確診歷時7年,提示本病患者尤其是幼年期患者的臨床確診比較困難,而早診斷并及時予以鵝去氧膽酸治療能明顯改善臨床癥狀、延緩疾病進程。因此,當未成年病患出現(xiàn)原因不明的跟腱腫物、智力低下、白內(nèi)障及頑固性腹瀉等癥狀時,鑒別診斷時應考慮患本病的可能性,如條件成熟,建議盡早做CYP27A1基因的突變篩查分子診斷。值得一提的是,除了CYP27A1基因突變可致腦腱黃瘤病,目前尚不能排除其他潛在致病基因存在的可能性,因為膽汁酸生物合成的過程需要多個酶的參與,而理論上相關基因的突變都可能會影響這些酶的活性,從而影響膽汁酸的生物合成過程,產(chǎn)生類似于腦腱黃瘤病的臨床表型。綜上所述,本研究對1例腦