柿葉多糖對糖尿病小鼠降血糖作用及其機(jī)制研究

卡其色最早出現(xiàn)在明代的云南草本植物中，后來在許多草本植物和醫(yī)書中。我國民間也有用柿葉泡茶飲的習(xí)慣。柿葉含有黃酮類、生物堿、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、酚類、香素、三萜類、多糖、有機(jī)酸、β-胡蘿卜素、維生素C、生物態(tài)等多種化學(xué)成分。急性毒性試驗、亞急性毒性試驗和長期毒性試驗均表明柿葉是一種安全的天然藥物。柿葉已被制成中成藥用于治療冠心病、心絞痛、高血壓等。目前國內(nèi)外有關(guān)柿葉有效成分應(yīng)用于糖尿病治療的藥理和臨床研究較少,本實驗探討柿葉多糖對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的降血糖作用,并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究,為柿葉開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1材料表面1.1柿葉粗多糖的制備柿葉粉碎,粗粉用70%乙醇冷浸30min后,回流提取2h,過濾,藥渣自然揮干乙醇,加水煮沸,微沸1.5h,過濾,濾渣再次加水煮沸,微沸1.5h,合并濾液,濾液于3000r·min-1離心20min,取上清液于微波干燥器濃縮濃縮液加95%乙醇,混勻、靜置24h,抽濾,濾渣依次用無水乙醇、丙酮洗滌5次,揮干溶劑后,經(jīng)Sevag法去蛋白處理,得柿葉粗多糖,經(jīng)化學(xué)定性鑒別,為多糖類化合物。1.2實驗動物及動物清潔級昆明種小鼠,雌雄兼有,體重(25±3)g,購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,合格證號SCXK(桂)2003-0003;動物飼料是由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心生產(chǎn)(標(biāo)準(zhǔn)飼料)。1.3試驗藥物鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ):深圳晶美公司進(jìn)口分裝,ProductID:380-010-G001。優(yōu)降糖(格列本脲Glibenclamide):浙江南洋藥業(yè)有限公司,規(guī)格2.5mg/片,批號20051101。血糖試劑盒:四川邁克科技股份有限責(zé)任公司生產(chǎn),批號1106121。胰島素放射免疫分析試劑盒:北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品,批號20070120。丙二醛(MDA)測定試劑盒:南京建成生物工程研究所第一分所,批號20061206。超氧化物歧化酶(SOD)測試盒:南京建成生物工程研究所第一分所,批號20070131?？捡R斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒:南京建成生物工程研究所第一分所,批號20070103。1.4實驗儀器與設(shè)備722S紫外分光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司。RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器:上海安亭實驗儀器有限公司。GC-1200γ放免計數(shù)盒:中國科技大學(xué)科技實業(yè)總公司中佳光電儀器分公司。微波真空干燥機(jī):WBZ-2,貴陽新奇微波工業(yè)有限責(zé)任公司。高速冷凍離心機(jī):TGL-16G-A,上海市金鵬分析儀器有限公司。2方法2.1檸檬酸/檸檸檬酸鈉緩沖液配制小鼠禁食12h,按文獻(xiàn)并做預(yù)試后,以150mg·kg-1鏈脲佐菌素(STZ)ip(STZ溶于0.1mol·L-1,pH4.2的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液中,現(xiàn)配現(xiàn)用,冰浴保存)。正常對照組小鼠ip等量上述緩沖液。72h后(小鼠采血前禁食12h)眼內(nèi)眥采血,50μL,用生理鹽水稀釋5倍,于離心機(jī)3500r·min-1離心15min,分離血清,用葡萄糖試劑盒測定小鼠空腹血糖(FBG),凡FBG≥11.1mmol·L-1視為糖尿病動物模型。2.2格列本推行推行柿葉多糖將成模小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、格列本脲組、柿葉多糖低、高劑量組,各組小鼠自由飲水、每組小鼠每日上午和下午2次給予同樣量飼料,以適當(dāng)控制攝食。ig給藥,格列本脲組(25mg·kg-1·d-1),柿葉多糖高低、高劑量組(150,600mg·kg-1·d-1),用時配成等體積不同濃度溶液(小鼠ig10mL·kg-1)。柿葉多糖用無水乙醇、吐溫、蒸餾水按1∶1∶10的比例配成溶液。成模后第2d開始給藥,每天上午空腹給藥1次,連續(xù)ig15d。模型對照組小鼠ig10mL·kg-1上述空白溶劑。2.3一般指標(biāo)觀察小鼠的精神活動、毛發(fā)改變、飲水量、進(jìn)食量、大小便等一般狀態(tài),并記錄體重變化情況、死亡情況等。2.4空腹血糖檢測造模第3d用采血針刺破眼內(nèi)眥,取血50μL,用生理鹽水稀釋5倍,于離心機(jī)3500r·min-1離心15min,分離血清,用葡萄糖試劑盒測定小鼠空腹血糖(FBG)。成模小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組,第2d開始給藥。以后分別在用藥第7,15d用葡萄糖氧化酶法測定各組FBG。2.5空腹胰島素水平給藥第15d,各組小鼠拔眼球采血,分離血清,用放射免疫法測定空腹胰島素(FINS)水平。計算胰島素敏感指數(shù)(ISI),計算公式:2.6小鼠血糖檢測測定重復(fù)2.1,2.2操作。用藥第3周時,各組口服葡萄糖2.5g·kg-1,分別測定0,0.5,1,2h各組小鼠血糖值,比較口服葡萄糖耐量(OGTT)變化情況,并計算糖耐量血糖曲線下面積(AUC)。2.7測定項目及方法各組小鼠給藥第15d拔眼球采血后,處死,取肝組織,用冰生理鹽水清洗,濾紙吸干,稱重后低溫冰箱冷凍保存,測定前取出用生理鹽水配成10%肝組織液,用高速勻質(zhì)機(jī)制成10%肝組織勻漿,于冷凍離心機(jī)3000r·min-1離心15min,取上清液按要求用生理鹽水稀釋一定倍數(shù)后用于肝組織蛋白含量、肝組織MDA、肝組織SOD測定。組織蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定法;MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法;SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法。2.8統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用x±s表示。采用SPSS11.5.統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1各組小鼠一般情況正常小鼠造模成功后出現(xiàn)精神萎靡,形體消瘦、多食、多飲和多尿等癥狀。ig給藥后,格列本脲組、柿葉多糖低、高劑量組較模型組小鼠狀態(tài)有較明顯改善,精神狀態(tài)良好。體重較模型組有所增加。3.2格列本對柿葉多糖低、高劑量對大鼠血糖的影響給藥期間,與同期糖尿病模型組比較,格列本脲組,柿葉多糖低、高劑量組,有顯著降低血糖的作用(P<0.01或0.05)。結(jié)果見表1。3.3兩組患者胰島素敏感指數(shù)比較STZ所致糖尿病小鼠與正常小鼠相比胰島素水平異常升高,出現(xiàn)胰島素抵抗,用藥后柿葉多糖低、高劑量組,胰島素敏感指數(shù)均提高。結(jié)果見表2。3.4糖耐量血糖曲線下面積與糖尿病模型組比較,柿葉多糖高劑量組口服葡萄糖后血糖水平下降較快,糖耐量血糖曲線下面積(AUC)與模型組比較有顯著性差異(P<0.01),且作用優(yōu)于格列本脲組(P<0.01或0.05)結(jié)果見表3。3.5小鼠肝組織抗氧化能力STZ所致糖尿病各組小鼠肝組織中MDA較正常組有顯著增高,SOD顯著降低,顯示糖尿病小鼠肝組織抗氧化能力下降。用藥15d后,與模型組比較柿葉多糖有效降低肝組織MDA,相應(yīng)增高SOD活力(P<0.01),結(jié)果見表4。3.6小鼠胰島細(xì)胞損傷顯微鏡下觀察:正常組織胰腺由漿液性腺細(xì)胞和導(dǎo)管組成,胰島由大小不等的細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成,分布在腺泡之間,胰島數(shù)量最多,體積較大;模型組胰腺由漿液性腺細(xì)胞和導(dǎo)管組成,胰島由大小不等的細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成,分布在腺泡之間,胰島細(xì)胞數(shù)量明顯減少,分布稀疏;表明STZ所致糖尿病小鼠胰島細(xì)胞有一定損傷。顯微鏡下胰島細(xì)胞計數(shù):各組胰腺內(nèi)胰島的分布總數(shù)平均為(n=3)∶正常組24(個/切片),模型組5(個/切片),格列本脲16(個/切片),柿葉多糖低劑量6(個/切片)、柿葉多糖高劑量17(個/切片)。結(jié)果提示:柿葉多糖對胰島細(xì)胞有一定的保護(hù)和修復(fù)作用。4提高抗氧化酶系統(tǒng)的檢測結(jié)果糖尿病患者最典型的臨床特征為高血糖,持續(xù)的高血糖不僅引起廣泛的周圍組織和器官的損害,而且高血糖對胰島β細(xì)胞亦有“細(xì)胞毒性作用”,因此在糖尿病的治療中如何有效持久地控制血糖成為關(guān)鍵。本實驗結(jié)果顯示,柿葉多糖對糖尿病小鼠的血糖具有顯著降低作用,同時其也能顯著改善糖尿病小鼠的糖耐量,而且其作用優(yōu)于格列本脲組;應(yīng)用柿葉多糖后,糖尿病小鼠狀態(tài)有較明顯的改善,精神狀態(tài)良好,死亡率低,并能減緩實驗性糖尿病小鼠體重的下降。文獻(xiàn)報道糖尿病患者和糖尿病動物模型的抗氧化能力均有下降,在糖尿病的發(fā)展過程中伴隨自由基對肝組織的氧化損傷,同時,鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的肝細(xì)胞腫大、輕度變形,肝竇變窄甚至消失,肝臟抗氧化能力顯著下降。本實驗結(jié)果表明,柿葉多糖能顯著提高肝臟SOD活性、降低MDA含量。顯微鏡下胰島細(xì)胞計數(shù):柿葉多糖高劑量組胰島細(xì)胞計數(shù)明顯增加,提示柿葉多糖對胰島細(xì)胞有較好的保護(hù)和修復(fù)作用。因此,提高抗氧化酶活性,增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力,清除活性氧自由基以解除自由基對肝臟和胰島β-細(xì)胞的損傷,促進(jìn)肝臟功能的恢復(fù)和胰島β-細(xì)胞的修復(fù)和再生,可能是柿葉多糖降血糖作用的機(jī)制之一。胰島素抵抗貫穿