杉木組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究

楠木又名紅景天，是馬鞭草科的一種植物。柚木原產(chǎn)印度、緬甸、泰國和印度尼西亞等地,是東南亞地區(qū)的主要造林樹種［1］。柚木兼具生長迅速、紋理美觀、耐腐抗蟲和易于加工等優(yōu)良特性,在國際上被譽(yù)為最重要的熱帶用材樹種之一［2］。主要用于制造軍艦和海輪,為軍需和航海的重要物資,也是建碼頭、橋梁、建筑、車箱、家具、雕刻、木器和貼面板、鑲貼板的高級(jí)用材［3］。在我國,隨著人們生活水平不斷提高,對天然實(shí)木產(chǎn)品的追求不斷增強(qiáng),柚木作為名貴優(yōu)質(zhì)的實(shí)木原料逐漸受到人們的喜愛。我國無柚木天然林分布,人工林多為20世紀(jì)60年代營造,且大多數(shù)已砍伐,目前保存的人工林多為萌芽更新的幼林。而緬甸是目前僅有的柚木原木出口國,我國每年的進(jìn)口的原木遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了國內(nèi)市場的需求,年缺口達(dá)50%以上。針對目前我國柚木原木供需的巨大矛盾,人工規(guī)?；嘀茶帜救斯ぴ狭质墙鉀Q這一問題的最有效途徑。發(fā)展柚木人工原料林種苗是關(guān)鍵。傳統(tǒng)的柚木種苗繁殖主要以種子繁殖為主,但柚木種子萌發(fā)的周期長,效率低,并且柚木母樹林和無性系種子園的種子產(chǎn)量也很有限［4］,柚木種苗數(shù)量無法滿足規(guī)?；炝值男枨?。采用組培快繁技術(shù),可在短期內(nèi)獲得大量優(yōu)良無性系試管苗［5］,是解決柚木種苗需求的有效途徑。1試驗(yàn)材料和方法1.1試驗(yàn)材料以廣西林業(yè)科學(xué)研究院珍貴鄉(xiāng)土闊葉樹種苗圃中培育的柚木3年生優(yōu)良無性系植株基部的萌條莖段作為外植體。1.2測試方法1.2.1外植體的處理取15~20cm健壯半木質(zhì)化枝條,將采回的枝條去除葉片后,用清水將附著枝條表面的泥土等污染物清洗干凈,再用沾有肥皂粉或洗潔精的軟毛刷進(jìn)行刷洗,后用去離子水清洗1~3次,沖洗后將枝條剪切成帶1~2個(gè)腋芽、長約1.5~2.0cm的莖段,無菌條件下用75%乙醇浸泡30s,無菌水清洗2次。外植體用2種方法處理,每種方法分別設(shè)3個(gè)不同的滅菌時(shí)間:(1)用0.1%HgCl2分別消毒6、8、10min,以振蕩的方式進(jìn)行滅菌處理,最后用無菌水沖洗6次。(2)用0.1%的HgCl2浸泡外植體2次,每次分別是3、4、5min,第1次HgCl2浸泡后用無菌水沖洗2次;然后倒入0.1%HgCl2浸泡,最后用無菌水沖洗6次,接種于培養(yǎng)基上。每處理30個(gè)外植體,培養(yǎng)基為MS附加細(xì)胞分裂素6-BA0.5mg/L。接種15天時(shí)統(tǒng)計(jì)外植體消毒效果。1.2.2入細(xì)胞分裂素測定選擇MS、DKW和WPM,3種基本培養(yǎng)基,在3種基本培養(yǎng)基中都加入細(xì)胞分裂素6-BA1mg/L。每種基本培養(yǎng)基接種消毒好的無菌莖段30段,以肉眼觀察到分化生長的芽時(shí)定為外植體始芽萌動(dòng),培養(yǎng)30天時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。外植體始芽誘導(dǎo)率=芽誘導(dǎo)的外植體數(shù)/接種總數(shù)×100%。1.2.3培養(yǎng)基組合設(shè)計(jì)將初代培養(yǎng)中獲得的無菌芽取下后轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中,選擇MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度的6-BA和NAA來研究影響柚木叢生芽發(fā)生的最適培養(yǎng)基組合。其中6-BA的濃度分別0、0.5、1、2mg/L,NAA的濃度分別0、0.25mg/L,采取完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)7個(gè)處理,每處理每瓶接種單芽6顆,5次重復(fù)。培養(yǎng)25天時(shí)以能切割剝離且長大于0.2cm的單芽為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計(jì)芽的增殖系數(shù)并記錄增殖芽的生長狀況。芽增殖系數(shù)=培養(yǎng)25天芽增殖總數(shù)/接種芽數(shù)。1.2.4培養(yǎng)基的選擇當(dāng)繼代培養(yǎng)擴(kuò)大到一定數(shù)量并生長到一定高度(3~4cm)時(shí)做生根培養(yǎng)試驗(yàn)。選擇NAA、IBA和基本培養(yǎng)基為試驗(yàn)因素,試驗(yàn)用L9(34)正交表試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1),設(shè)計(jì)9個(gè)處理,每處理接種單芽6顆,5次重復(fù)。各處理外加1.5%蔗糖和3.5g/L瓊脂。25天統(tǒng)計(jì)各處理的生根率。生根率=單芽生根株數(shù)/接種總數(shù)×100%。1.2.5脂、高溫滅菌上述培養(yǎng)基內(nèi)有特別說明外,其余均含3%蔗糖、瓊脂3g/L,pH值為6.8,高溫滅菌15~20min。培養(yǎng)室溫度(25±2)℃,光照強(qiáng)度2000~5000lx。2結(jié)果與分析2.1不同消毒方法對高安全性細(xì)胞菌群的消毒效果,hgcl2消毒采用不同消毒方法對柚木莖段進(jìn)行表面消毒處理。在6~10min的消毒時(shí)間內(nèi),0.1%升汞對外植體進(jìn)行消毒隨著時(shí)間越短,污染率越高(表2)。而消毒的時(shí)間延長雖然能降低污染率,無菌褐死數(shù)卻增加,其原因是,HgCl2消毒時(shí)間過長會(huì)對組織細(xì)胞產(chǎn)生毒害殺傷莖段,無菌活體獲得率反而下降。而用0.1%的HgCl2浸泡外植體2次的消毒方法,污染率和無菌褐死率的變化趨勢與用0.1%的HgCl2浸泡外植體1次的消毒方法基本一致。在相同的0.1%HgCl2消毒時(shí)間內(nèi),用0.1%的HgCl22次的消毒方法優(yōu)于1次的消毒方法,無菌活體的獲得率更高。在0.1%HgCl2浸泡外植體2次的消毒方法中,先消毒4min,無菌水清洗后再消毒4min的處理無菌活體的獲得率為30%,為各處理最佳。2.2外植體始芽多態(tài)性將外植體接種到3種培養(yǎng)基進(jìn)行始芽的誘導(dǎo)培養(yǎng),在培養(yǎng)10天后,各種培養(yǎng)基中的莖段的腋芽陸續(xù)開始萌動(dòng),同時(shí)莖基部處逐漸膨大,形成白色愈傷組織。在培養(yǎng)20天后,芽基部的愈傷組織不斷增大,直徑可達(dá)1.5cm以上。而腋芽也不斷伸長,長度在2~3.5cm,腋芽基部周圍產(chǎn)生數(shù)量不等的叢生芽(1~5個(gè))。在培養(yǎng)30天后,芽基部愈傷組織停止增大,沒發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)出不定芽。腋芽繼續(xù)伸長生長,最長的芽可達(dá)5cm以上。從表3可以看出,基本培養(yǎng)基對外植體始芽萌動(dòng)的影響差異較大。培養(yǎng)30天,MS的誘導(dǎo)率為各處理中最高,達(dá)86.7%,而且每個(gè)無菌活體莖段平均能誘導(dǎo)出4.7個(gè)小芽,也為各處理最高。在MS基本培養(yǎng)基中生長,芽葉色濃綠,生長健壯。3種基本培養(yǎng)基最不適合柚木生長的是DKW,在其生長的芽細(xì)長、葉色發(fā)白、長勢較弱,平均每個(gè)莖段只能誘導(dǎo)出1.6個(gè)芽。2.3-ba對3種常用植物愈傷組織的影響激素對柚木不定芽增殖有很大的作用。在不加任何激素的培養(yǎng)基中,沒有愈傷組織的形成,也不能誘導(dǎo)出叢芽,只有60%的無菌芽能誘導(dǎo)出單芽,但單芽生長25天后,下部葉子開始發(fā)黃,30天后葉子變褐死亡,芽纖細(xì)長勢差。在添加了激素的培養(yǎng)基中,無論濃度是多少,芽的基部都會(huì)形成愈傷組織,且隨著6-BA濃度的增大,愈傷組織的直徑也隨之增大,說明柚木是容易誘導(dǎo)愈傷組織的植物,但沒見有不定芽從愈傷組織中分化出來。細(xì)胞分裂素6-BA對柚木不定芽增殖也有較大的影響,而生長素對柚木不定芽增殖卻影響不大。在相同的6-BA濃度下,無論添加NAA與否,柚木組培芽的增殖系數(shù)變化不大,多重比較兩者的差異不顯著。柚木不定芽的增殖系數(shù)隨著6-BA濃度的升高而增加,當(dāng)6-BA濃度為mg/L,柚木不定芽的增殖系數(shù)最高,達(dá)到6.1以上,且叢生芽生長健壯。當(dāng)6-BA濃度大于1mg/L時(shí),柚木不定芽的增殖系數(shù)不但下降,而且叢芽的質(zhì)量較差,并伴有輕度的玻璃化現(xiàn)象。2.4對技術(shù)路線的影響R值(極差)表示因素對指標(biāo)影響的大小,即因素的重要性。極差越大,該因素的水平改變時(shí)對指標(biāo)的影響越大。3個(gè)因素R值大小分別次序?yàn)?基本培養(yǎng)基>NAA>IBA;說明對柚木生根影響最大的因素為基本培養(yǎng)基,其次是NAA,影響因素最小是IBA(表5)。直觀分析法也可得到各因素的較優(yōu)水平,在基本培養(yǎng)基中以1/2MS為較優(yōu)水平,而NAA濃度的較優(yōu)水平為1.0mg/L,IBA的較優(yōu)水平是2.0mg/L。在上述生根試驗(yàn)處理中,沒有出現(xiàn)各因素的最優(yōu)組合處理,但在次優(yōu)水平的組合1/2MS+NAA1.0mg/L+IBA0.5mg/L的生根培養(yǎng)基中,柚木的生根率可達(dá)到90%,且根系質(zhì)量較好,一般可以長3~4條根。如果柚木單芽在理論中最優(yōu)的生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA1.0mg/L+IBA2.0mg/L中誘導(dǎo)生根,其生根效果可能會(huì)更好,但其結(jié)果還需有待實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。3組培植物的生長特性(1)柚木莖段表明長滿小毛,導(dǎo)致莖段的表面積大大增大,微生物大量附著其上,如果用0.1%HgCl2消毒時(shí)間過短,消毒不徹底易于長菌。但HgCl2具有較強(qiáng)的細(xì)胞滲透能力,外植體消毒時(shí)間過長,消毒液對組織細(xì)胞有明顯的毒害作用,影響外植體存活。本研究用0.1%的HgCl2浸泡外植體,用無菌水清洗后再用0.1%的HgCl2浸泡的消毒效果較好,HgCl2對外植體的毒害減小,無菌體獲得率有一定的提高。(2)基本培養(yǎng)基是植物組培苗生長的營養(yǎng)物質(zhì)基礎(chǔ),各種無機(jī)離子的濃度比例直接影響到植物的生長。本研究表明,MS是柚木組培的較適基本培養(yǎng)基,柚木在其中生長,葉色濃綠、長勢良好。細(xì)胞分裂素6-BA是柚木增殖培養(yǎng)最關(guān)鍵的激素,柚木增殖培養(yǎng)最適合的6-BA濃度為1mg/L,柚木不定芽的增殖系數(shù)可達(dá)6.1以上,且叢生芽生長健壯。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),只要加了6-BA的培養(yǎng)基,無論濃度是多少,柚木都會(huì)有愈傷組織的形成,說明柚木易于形成愈傷