不同培養(yǎng)基及外植體對(duì)土木愈傷組織生長(zhǎng)的影響

楠木樹(shù)是一棵具有超大背景的熱帶樹(shù)，結(jié)構(gòu)致密，材料堅(jiān)硬，無(wú)變形和開(kāi)裂，質(zhì)地筆直，質(zhì)地光滑，耐腐蝕性和抗蟲(chóng)性。廣泛應(yīng)用于家具、雕塑等生產(chǎn)材料。這是世界上著名的材料樹(shù)種。目前,國(guó)內(nèi)外的柚木的組培快繁技術(shù)已經(jīng)非常成熟,而且我國(guó)的柚木快繁技術(shù)現(xiàn)已完全達(dá)到了工廠化育苗的要求,但我國(guó)引種的柚木在栽培上還面臨著樹(shù)木最初開(kāi)花期過(guò)早(影響主干高度生長(zhǎng)),土壤酸性、低溫凍害、病蟲(chóng)害等問(wèn)題的困擾,利用植物基因工程對(duì)延遲其最初開(kāi)花時(shí)間、改良柚木材性、增強(qiáng)抗逆性等優(yōu)良性狀是一個(gè)行之有效的途徑,而愈傷組織誘導(dǎo)是實(shí)現(xiàn)這一途徑的基礎(chǔ)。有關(guān)柚木愈傷組織誘導(dǎo)及再生的研究報(bào)道較少,而且基本為國(guó)外的研究報(bào)道,我國(guó)在此方面的研究較遲,尤其是針對(duì)性地進(jìn)行柚木愈傷組織誘導(dǎo)的相關(guān)研究尚未有報(bào)道。作者借鑒前人的研究成果,通過(guò)對(duì)基本培養(yǎng)基的篩選和對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn),旨在篩選出柚木愈傷組織生長(zhǎng)較好的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件,為柚木的再生體系建立、遺傳轉(zhuǎn)化等生物技術(shù)的研究奠定初步的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1組培瓶苗的選擇供試材料為中國(guó)林科院熱帶林業(yè)研究所選育的柚木優(yōu)良無(wú)性系7114無(wú)菌苗,該無(wú)性系選自海南尖峰嶺柚木種源試驗(yàn)的優(yōu)良單株,是經(jīng)初代及繼代培養(yǎng)后的組培瓶苗。1.2生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇及其對(duì)莖段“不帶來(lái)源”愈傷組織生長(zhǎng)的影響培養(yǎng)基及外植體篩選試驗(yàn)采用MS,1/2MS,WPM培養(yǎng)基,以葉片、帶節(jié)間的莖段、不帶節(jié)間的莖段、莖尖(即無(wú)菌苗頂芽)為外植體。不同光照條件(暗培養(yǎng)7、14、21、28d,并以一直暗培養(yǎng)為對(duì)照,共5個(gè)處理)、培養(yǎng)方式(濾紙橋液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng))以及培養(yǎng)時(shí)間(5、10、15、20、25、30、35d)對(duì)莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)采用MS培養(yǎng)基。以上試驗(yàn)均加入1.0mg·L-16-BA和0.5mg·L-1NAA。在MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA(0.5、1、2mg·L-1)和6-BA(0、0.5、1、1.5、2、3、4mg·L-1)組合的雙因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),研究NAA與6-BA兩種激素對(duì)莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)。培養(yǎng)基中均加入蔗糖30g·L-1,用瓊脂7g·L-1固化,pH在高壓滅菌前調(diào)至5.8。上述實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理接種外植體30個(gè),重復(fù)3次。1.3愈傷組織觀察培養(yǎng)室溫度(25±2)℃,每日光照時(shí)數(shù)10h,光照強(qiáng)度1800~2000lx(暗培養(yǎng)除外),觀察4~6周后,統(tǒng)計(jì)愈傷組織發(fā)生情況。所有百分率數(shù)據(jù)在進(jìn)行方差分析前經(jīng)反正弦變換,采用SPSS14.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和最小顯著差異性檢驗(yàn)(LSD法,P<0.05)。2結(jié)果與分析2.1ms培養(yǎng)基的誘導(dǎo)愈傷組織方差分析結(jié)果(見(jiàn)表1)表明,外植體間柚木愈傷誘導(dǎo)率差異極顯著(P<0.01),其中不帶節(jié)間的莖段、葉片最好,誘導(dǎo)率均達(dá)到70%以上,它們與帶節(jié)間莖段和莖尖的誘導(dǎo)率相比差異顯著和極顯著。3種基本培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基與外植體的交互作用對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響達(dá)到顯著水平,多重比較表明MS基本培養(yǎng)基要好于1/2MS、WPM基本培養(yǎng)基。外植體接入培養(yǎng)基后10d左右首先在切口處開(kāi)始萌動(dòng),產(chǎn)生愈傷的質(zhì)地、狀態(tài)以MS培養(yǎng)基最好。MS培養(yǎng)基產(chǎn)生的愈傷基本呈黃色到乳黃色、為致密的,顆粒狀的愈傷組織。1/2MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷為乳黃色,呈水漬狀,不適宜進(jìn)一步的繼代培養(yǎng)。WPM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷莖段(不帶節(jié)間)為乳白色到灰白色,質(zhì)地疏松,易碎,無(wú)光澤,帶節(jié)間莖段及葉片的愈傷長(zhǎng)的較慢呈黃色致密狀。莖尖在此處理?xiàng)l件下只有在MS培養(yǎng)基中才會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷(見(jiàn)圖1),說(shuō)明了MS培養(yǎng)基適宜不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)。觀察還發(fā)現(xiàn),在MS培養(yǎng)基中一般帶節(jié)間的莖段產(chǎn)生的愈傷基本是在腋芽萌發(fā)后產(chǎn)生較大的愈傷(平均直徑9mm),若腋芽未萌發(fā)則或者不產(chǎn)生愈傷或者愈傷很小(平均直徑2mm)。WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的帶節(jié)間的莖段的腋芽長(zhǎng)的很小,這也是在進(jìn)行柚木快繁時(shí)采用MS為基本培養(yǎng)基的原因。由圖1可知MS培養(yǎng)基中外植體不帶節(jié)間的莖段的誘導(dǎo)率最高,達(dá)到74.47%,其次是葉片、帶節(jié)間的莖段和莖尖,誘導(dǎo)率分別為74.24%、45.45%和33.33%。葉片誘導(dǎo)的愈傷在后期的繼代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)其較易褐化,莖段(不帶節(jié)間)愈傷的生活力相對(duì)較旺盛,適合用來(lái)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。權(quán)衡愈傷組織的誘導(dǎo)率及其生長(zhǎng)情況,使用MS培養(yǎng)基較合適,外植體采用不帶節(jié)間的莖段較好。2.2暗培養(yǎng)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)分別暗培養(yǎng)7、14、21、28d后,再進(jìn)行光培養(yǎng),以暗培養(yǎng)為對(duì)照,共5種不同的光照處理模式,30d后愈傷組織的出愈率結(jié)果表明,暗培養(yǎng)28d后轉(zhuǎn)為光培養(yǎng)的處理愈傷組織的誘導(dǎo)率顯著高于其它4種處理(P<0.05)(見(jiàn)表2),說(shuō)明暗培養(yǎng)對(duì)柚木莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織誘導(dǎo)有很大的影響。適宜的暗處理有利于莖段(不帶節(jié)間)愈傷的生長(zhǎng),同時(shí)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)1~2周后將外植體放于光下培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷雖然顏色、質(zhì)地差異不大,但產(chǎn)生的愈傷大小要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于暗培養(yǎng)3~4周后的愈傷,且生長(zhǎng)狀況也不如后者。始終暗培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率低于暗培養(yǎng)28d后再光照的處理,說(shuō)明適當(dāng)?shù)墓馀囵B(yǎng)對(duì)柚木莖段(不帶節(jié)間)愈傷的誘導(dǎo)也有一定的促進(jìn)作用,光暗交替培養(yǎng)可以有效提高愈傷的誘導(dǎo)率。2.3濾紙橋液體誘導(dǎo)在MS培養(yǎng)基上分別設(shè)置濾紙橋液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種方式誘導(dǎo)莖段(不帶節(jié)間)愈傷。由表3可看出采用濾紙橋液體誘導(dǎo)的方式愈傷誘導(dǎo)率要好于固體培養(yǎng)基,愈傷為綠色,有光澤,致密;固體培養(yǎng)基產(chǎn)生淺黃色或黃綠色、致密的愈傷組織,但前者愈傷需要15d左右時(shí)間才有愈傷產(chǎn)生,固體培養(yǎng)基7d左右便可見(jiàn),總體認(rèn)為濾紙橋液體培養(yǎng)方式好于固體培養(yǎng)方式,有利于愈傷的誘導(dǎo)。2.4-ba和naa對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)選擇NAA和6-BA的組合為激素配比,以MS為基本培養(yǎng)基,添加30g·L-1蔗糖、7g·L-1瓊脂,接入7mm長(zhǎng)的無(wú)菌幼苗莖段(不帶節(jié)間)。35d后統(tǒng)計(jì)外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織的平均直徑及其誘導(dǎo)率。從表4中可以發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加生長(zhǎng)素NAA(濃度0.5~2mg·L-1)不能誘導(dǎo)莖段(不帶節(jié)間)產(chǎn)生愈傷組織,外植體只是腫脹,有些會(huì)長(zhǎng)出白色透明的須根。當(dāng)6-BA與NAA共同作用后會(huì)誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)會(huì)產(chǎn)生兩種類(lèi)型愈傷,一種為致密型的;一種為疏松易碎型。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度低于2mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生顏色為淺黃到黃色的致密的愈傷,高于或等于2mg·L-1時(shí)產(chǎn)生黃色到黃綠色的疏松易碎的愈傷組織,并且前種愈傷誘導(dǎo)率較低,在本試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)產(chǎn)生致密的愈傷以1mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA組合誘導(dǎo)率最高,平均直徑大小隨著NAA濃度的增大呈逐漸減小的趨勢(shì)。對(duì)于第二種疏松型的愈傷組織誘導(dǎo)率基本都能夠達(dá)到50%以上,這種愈傷適用于進(jìn)行液體懸浮繼代培養(yǎng),6-BA與NAA濃度比在1~1.5mg·L-1有利于愈傷組織的生長(zhǎng),此類(lèi)愈傷以2mg·L-16-BA+2mg·L-1NAA為最好的激素組合。方差分析結(jié)果顯示(見(jiàn)表5),兩種激素以及其交互作用對(duì)柚木幼苗莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織誘導(dǎo)率及愈傷直徑大小均達(dá)到了顯著差異(p<0.05)。綜合考慮認(rèn)為NAA濃度選擇0.5mg·L-1,1mg·L-1較好,6-BA濃度選擇1~3mg·L-1較適宜,濃度過(guò)高過(guò)低均不利于愈傷的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)。2.5生長(zhǎng)平穩(wěn)期對(duì)不同培養(yǎng)天數(shù)的柚木愈傷組織鮮重建立了柚木愈傷組織生長(zhǎng)曲線,從圖2可以看出柚木愈傷組織的生長(zhǎng)曲線大致呈S形。愈傷生長(zhǎng)萌動(dòng)期較長(zhǎng),接種后的前20d生長(zhǎng)曲線較為平滑,這段期間可以看到切口處產(chǎn)生很少淺黃色透明的愈傷組織,20d后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在20~30d期間,愈傷組織生長(zhǎng)速度明顯加快,可以看到愈傷組織長(zhǎng)滿整個(gè)外植體,且28d后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng),愈傷組織生長(zhǎng)快速加快與此期間的光照培養(yǎng)應(yīng)該也有很大關(guān)系。30~35d愈傷生長(zhǎng)變緩,處于生長(zhǎng)平穩(wěn)期。所以可以認(rèn)為柚木愈傷組織最適繼代時(shí)間為30~35d,這一研究與陳榮、李琰等人對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的研究相似。3-ba與naa、2,4-d的激素對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效果植物愈傷組織的誘導(dǎo)主要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境三大因素的調(diào)控。一般認(rèn)為,高鹽的基本培養(yǎng)基較適合愈傷組織的生長(zhǎng),在本試驗(yàn)中高鹽的MS培養(yǎng)基適合柚木愈傷組織生長(zhǎng),中鹽的1/2MS和WPM雖也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷,但愈傷或水漬化或無(wú)光澤,生活力不強(qiáng),不適宜莖段(不帶節(jié)間)愈傷組織的誘導(dǎo)。Baghel等在對(duì)不同基本培養(yǎng)基的選擇試驗(yàn)中也采用MS培養(yǎng)基用于愈傷誘導(dǎo)以及再生全過(guò)程,他們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)外植體在MS培養(yǎng)基中愈傷生長(zhǎng)的綜合反應(yīng)好于其它培養(yǎng)基。Kushalkar等也采用MS培養(yǎng)基應(yīng)用于柚木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究。當(dāng)然也有學(xué)者認(rèn)為1/2MS,WPM培養(yǎng)基為柚木愈傷誘導(dǎo)較適的培養(yǎng)基,這有可能是因?yàn)橥庵搀w不同,或者使用的激素種類(lèi)不同導(dǎo)致對(duì)不同基本培養(yǎng)基的反應(yīng)不同,所產(chǎn)生的愈傷質(zhì)地不同。本試驗(yàn)中以6-BA和NAA兩種激素共同處理的情況下,MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷質(zhì)地,顏色均好于另外兩種基本培養(yǎng)基,因此,認(rèn)為MS培養(yǎng)基為最適的基本培養(yǎng)基。由于植物組織或細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下往往缺乏合成生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的能力,為了使細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和分裂,在多數(shù)情況下需要生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素兩種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用,而且很多研究表明生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素配合使用時(shí)效果更好。Rosilah在對(duì)柚木愈傷組織誘導(dǎo)的試驗(yàn)中研究也證明6-BA與NAA這兩種激素共同作用有利于愈傷的誘導(dǎo)。Baghel等采用子葉、上胚軸等部位做為外植體時(shí)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加生長(zhǎng)素NAA、2,4-D都可以誘導(dǎo)愈傷的產(chǎn)生。筆者在前期預(yù)試驗(yàn)過(guò)程中曾采用葉片為外植體,單獨(dú)添加生長(zhǎng)素NAA(0.5mg·L-1)進(jìn)行誘導(dǎo),也可以產(chǎn)生愈傷,而本試驗(yàn)采用莖段(不帶節(jié)間)為外植體,在只含有NAA(0.5~2mg·L-1)的培養(yǎng)基上,愈傷組織的誘導(dǎo)率為零,當(dāng)和一定濃度的6-BA配合使用時(shí),愈傷組織的誘導(dǎo)率大大提高,產(chǎn)生的愈傷組織較多且質(zhì)量好,而且有利于愈傷組織的增殖,這種現(xiàn)象說(shuō)明柚木的不同外植體內(nèi)部的激素含量水平不同,促使激素對(duì)外植體的愈傷誘導(dǎo)效果存在差異,即由于外植體或基因型不同,導(dǎo)致各自的生理狀態(tài)和所處的生育時(shí)期不同,其內(nèi)源激素濃度和比例不同,以至于出現(xiàn)不同植物的器官和組織,其形態(tài)發(fā)生能力大不相同,或者即使同種植物不同部分做外植體時(shí),所需要的營(yíng)養(yǎng)和植物激素的用量也不相同。本試驗(yàn)中產(chǎn)生兩種類(lèi)型的愈傷組織(圖3),方差分析表明與6-BA的濃度有關(guān),當(dāng)6-BA處于低濃度狀態(tài)下(小于2mg·L-1)產(chǎn)生致密的愈傷組織,高濃度下(大于或等于2mg·L-1)產(chǎn)生疏松的愈傷。細(xì)胞分裂素的主要生理作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和擴(kuò)大,誘導(dǎo)芽的分化,促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)生長(zhǎng),抑制衰老;而生長(zhǎng)素主要是促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂,誘導(dǎo)受傷的組織表面一至數(shù)層細(xì)胞恢復(fù)分裂能力,形成愈傷組織,誘導(dǎo)生根。本試驗(yàn)中單獨(dú)添加生長(zhǎng)素NAA(濃度為1~2mg·L-1時(shí)),莖段(不帶節(jié)間)外植體有須根產(chǎn)生就是由于生長(zhǎng)素有促進(jìn)生根這一作用的原因。Baghel等采用不同的激素處理產(chǎn)生了不同狀態(tài)、質(zhì)地、顏色的愈傷,有致密的,疏松的易碎的;表面干燥的,水漬狀的;顏色有白色的、深綠或淺綠、黃色的。許耀祖等在研究薰衣草愈傷誘導(dǎo)情況也發(fā)現(xiàn)采用同樣兩種激素處理會(huì)產(chǎn)生兩種不同類(lèi)型的愈傷組織,這些都證明了不同外植體、不同的激素類(lèi)型以及激素比例產(chǎn)生的愈傷類(lèi)型也會(huì)存在很大差異。本試驗(yàn)中兩種愈傷組織都不易褐化,有生活力,適于進(jìn)行再生分化誘導(dǎo)的愈傷組織因植物種類(lèi)、外植體等因素不同既有較致密型的又有疏松易碎型的,其中前者適合用于固體培養(yǎng),后者為進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)較適愈傷組織。Widiyanto等將產(chǎn)生的淺黃色致密的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng),最終誘導(dǎo)產(chǎn)生了再生植株。Rosilah等將產(chǎn)生的白色易碎的愈傷進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng),愈傷產(chǎn)生了胚狀體的初期結(jié)構(gòu)(近心型胚)。根據(jù)愈傷質(zhì)地、誘導(dǎo)率及平均直徑大小三項(xiàng)指標(biāo)認(rèn)為本試驗(yàn)中激素濃度組合MS+0.5mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA及MS+2mg·L-1NAA+2mg·L-16-BA為于愈傷組織的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基。在愈傷組織誘導(dǎo)階段,一般采用全暗、周期性光照、散射性光照三種形式。愈傷組織的誘導(dǎo)一般需弱光或不需光,而愈傷組織生長(zhǎng)往往需要光照。根據(jù)愈傷組織生長(zhǎng)曲線也可知培養(yǎng)到第3周后愈傷開(kāi)始大量生長(zhǎng),而不同暗培養(yǎng)處理中,暗培養(yǎng)兩周后將外植體轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)率不高,而且長(zhǎng)勢(shì)也不如之后的處理,說(shuō)明愈傷誘導(dǎo)前期需要3周左右的暗培養(yǎng)時(shí)間,然后愈傷進(jìn)入分裂期,開(kāi)始迅速生長(zhǎng),這時(shí)候進(jìn)行光培養(yǎng)可以促進(jìn)愈傷的生長(zhǎng)。如果僅進(jìn)行光培養(yǎng)或暗培養(yǎng)誘導(dǎo)率均為75%左右,但本試驗(yàn)先暗培養(yǎng)28d然后進(jìn)