第第頁二胺氧化酶（DiamineOxidase，DAO）試劑盒說明書二胺氧化酶（DiamineOxidase，DAO）試劑盒說明書微量法100T/48S注意：正式測定之前選擇23個(gè)預(yù)期差別大的樣本做猜測定。測定意義：DAO（EC1.4.3.6）廣泛存在于動(dòng)物（腸粘膜、肺、肝臟、腎臟等）、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛，其活性與核酸和蛋白合成緊密相關(guān)，能夠反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度。測定原理：DAO催化尸胺產(chǎn)生醛和過氧化氫，外源添加過量的辣根過氧化物酶，催化過氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺生成氧化型鄰聯(lián)茴香胺，在460nm處有特征汲取峰，通過測定該波長吸光度加添速率，計(jì)算DAO活性。自備試驗(yàn)用品及儀器：天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。試劑構(gòu)成和配制：提取液：液體120mL×1瓶，4℃保管。試劑一：液體0.3mL×1支，4℃保管。試劑二：液體2.5mL×1瓶，4℃保管。試劑三：液體1.2mL×1管，4℃保管。粗酶液提?。?.組織：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。2.細(xì)菌、真菌：依照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波碎裂細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。3.血清等液體：直接測定。測定操作表：1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)整波長至460nm，蒸餾水調(diào)零。2、操作表對(duì)照管測定管粗酶液（μL）5050提取液（μL）128108試劑一（μL）22試劑二（μL）2020試劑三（μL）20混勻，37℃水浴30min，微量石英比色皿/96孔板，蒸餾水調(diào)零，測定460nm吸光值。ΔA=A測定A對(duì)照。酶活性計(jì)算公式：a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。DAO活性（nmol/min/mgprot）=×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=18×A460÷Cpr（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。DAO活性（nmol/min/g鮮重）=×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T=18×A460÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。DAO活性（nmol/min/104cell）=×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T=18×A460÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。DAO活性（nmol/min/mL）=×V反總÷V樣÷T=18×A460ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30minb.用96孔板測定的計(jì)算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。DAO活性（nmol/min/mgprot）=×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=36×A460÷Cpr（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。DAO活性（nmol/min/g鮮重）=×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T=36×A460÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。DAO活性（nmol/min/104cell）=×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T=36×A460÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。DAO活性（nmol/min/mL）=×V反總÷V樣÷T=36×A460ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5L/mmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr