法國枳桐花粉變應(yīng)原純化及主要變應(yīng)原免疫活性分析

法國梧桐花是春天重要的過敏花粉。近年來，她被列入春季花粉過敏組，進(jìn)行診斷和脫敏治療，但對(duì)過敏成分的國內(nèi)研究甚少。本研究擬對(duì)其變應(yīng)原組分進(jìn)行分離純化并分析其免疫活性,為今后進(jìn)一步制備單抗及基因工程生產(chǎn)花粉變應(yīng)原奠定基礎(chǔ),從而提高過敏性哮喘的診治水平。1對(duì)象和方法1.1哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)收集我院變態(tài)反應(yīng)?？崎T診法國梧桐花粉過敏性哮喘患者7例,其中男性3例,女性4例。哮喘診斷根據(jù)全國第二屆哮喘會(huì)議制定的標(biāo)準(zhǔn)。法國梧桐花粉過敏的診斷,根據(jù)典型的花粉過敏病史,法國梧桐花粉變應(yīng)原皮內(nèi)試驗(yàn)風(fēng)團(tuán)直徑≥++。1.2方法1.2.1法國梧桐粉素濃縮液的制備于3月中旬至4月上旬采集當(dāng)?shù)丶儍舴▏嗤┗ǚ?9號(hào)分樣篩除雜質(zhì),乙醚脫脂。1.2.2柱內(nèi)充填法提取液稱取SephadexG-10015g于蒸餾水350mL中溶脹。將糊狀的SephadexG-100凝膠一次傾入潔凈層析柱中,使之自然沉降。待凝膠沉積后,將多余的溶劑放出,將濃縮的粗制液2mL加至凝膠柱上,打開管夾,使粗制液流入柱內(nèi),連接恒流泵,加入0.1mol·L-1pH7.4PBS洗脫,用核酸蛋白質(zhì)儀監(jiān)測(cè)洗脫情況,得洗脫曲線,有兩個(gè)峰,分別收集峰1的升段、峰段、降段、峰2升段。峰2降段富含色素,只含微量蛋白,棄之。重復(fù)上述洗脫過程,經(jīng)濃縮、透析、離心,將濃縮后各段洗脫液混合收集,4℃冰箱冷存?zhèn)溆谩?.2.3預(yù)測(cè)凝膠層壓電泳取標(biāo)準(zhǔn)蛋白、粗制液、峰1的升段、峰段、降段、峰2升段各20μL進(jìn)行SDS電泳,采用不連續(xù)PAGE,110g·L-1分離膠,50g·L-1濃縮膠,電極緩沖液pH8.3。電泳在室溫中進(jìn)行,電壓為150V,染料遷移至凝膠下端處,停止電泳。將凝膠片取出,染色1h,傾出染色液,用蒸餾水洗凝膠數(shù)次后加入脫色液,數(shù)小時(shí)換液一次,直到背景清晰。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管分子質(zhì)量計(jì)算各組分蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)。1.2.4凝膠的“東南角”切取電泳凝膠相同大小的聚乙烯二氟膜(PVDF膜),以電轉(zhuǎn)移緩沖液潤(rùn)濕,分別放在電泳后的凝膠上,用潤(rùn)濕的Whatman3mm濾紙支持,將第二塊潤(rùn)濕的濾紙貼在凝膠的另一面,形成一套夾心的“三明治”。將“三明治”放置在兩塊充分浸潤(rùn)的泡沫墊之間,置入盛有電轉(zhuǎn)移緩沖液的電泳槽內(nèi),電泳2h,取出PVDF膜夾在兩張濾紙之間干燥。1.2.5兔抗人igg-hrp、兔抗人ige-hrp的制備將PVDF膜切成2mm寬的條帶分別置于轉(zhuǎn)移槽中,用PBS緩沖液洗3次,用含40g·L-1脫脂奶粉封閉,置于搖床搖約1h,再用PBS緩沖液洗3次,然后各加入50μL陽性血清,37℃搖動(dòng)3h,用PBS緩沖液洗3次后分別加入兔抗人IgG-HRP、兔抗人IgE-HRP5μL,37℃搖動(dòng)1h,再用PBS緩沖液洗3次。加底物溶液反應(yīng)至抗原區(qū)帶呈現(xiàn)紫色后終止反應(yīng),將PVDF膜夾在濾紙中干燥,成像后暗處保存。2結(jié)果2.1l-1ph對(duì)小鼠血清中蛋白質(zhì)的提取濃縮法國梧桐花粉粗制液過SephadexG-100層析柱,用0.01mol·L-1pH7.4PBS洗脫,洗脫曲線(圖1)為兩個(gè)峰,第一峰及第二峰升段富含蛋白,第二峰降段含有大量色素,蛋白含量甚微,棄之。收集第一峰及第二峰升段洗脫液。2.2蛋白區(qū)帶及分子質(zhì)量SDS結(jié)果取標(biāo)準(zhǔn)蛋白、粗制液、峰1的升段、峰段、降段、峰2升段各20μL進(jìn)行SDS,結(jié)果見圖2。從圖2中可見,10余條深淺不一的蛋白區(qū)帶,分子質(zhì)量主要介于16～17ku之間。其中6條帶蛋白含量較多,分子質(zhì)量分別為71、50、35、39、22、16ku。第一峰升段、峰段、降段電泳圖相似,主要含分子質(zhì)量22～71ku之蛋白質(zhì),第二峰升段以分子質(zhì)量為14～16ku之蛋白質(zhì)為主。2.3免疫試驗(yàn)的結(jié)果7例法國梧桐花粉過敏的哮喘患者免疫印跡檢測(cè)均有陽性區(qū)帶出現(xiàn)(圖3),而無法國梧桐花粉過敏的哮喘患者血清呈陰性反應(yīng),無反應(yīng)區(qū)帶出現(xiàn)。3蛋白分子質(zhì)量及免疫印跡檢測(cè)法國梧桐又稱二球懸鈴木,為落葉喬木,屬懸鈴木屬。原產(chǎn)于歐洲,我國于60年代后大量栽培作行道、公園、庭院等綠化樹種,目前廣布各地,其中以法國梧桐最多見,其花期為4月中旬至5月上旬,花粉產(chǎn)量很大,風(fēng)媒傳播,在花期空氣中花粉含量很高。由于體積微小,極易被吸入呼吸道引起變態(tài)反應(yīng)性疾病。由于花粉變應(yīng)原浸液中含有無變應(yīng)原作用的物質(zhì)和對(duì)機(jī)體有刺激作用的成分,因此有必要分離純化花粉主要變應(yīng)原并確定它們的成分和免疫學(xué)特性。多數(shù)學(xué)者采用凝膠層析分離變應(yīng)原蛋白,PuttonenE等用凝膠層析法葡聚糖凝膠SephadexG-75分離樺樹花粉變應(yīng)原,變應(yīng)原活性主要在分子質(zhì)量為10～15ku蛋白質(zhì)之間。國內(nèi)龍如章等用SephadexG-75分離銀杏樹花粉變應(yīng)原,分子質(zhì)量30～42ku蛋白質(zhì)為主要變應(yīng)原成分。本研究采用SephadexG-100將法國梧桐花粉進(jìn)行層析,得兩個(gè)洗脫峰,經(jīng)SDS檢測(cè)各段蛋白質(zhì)分子質(zhì)量,結(jié)果表明,第一峰蛋白質(zhì)含量高,分子質(zhì)量為22～71ku,第二峰升段以分子質(zhì)量14～16ku之蛋白質(zhì)為主,第二峰降段僅有弱染色帶,說明此部分蛋白質(zhì)分子質(zhì)量低于14ku。免疫印跡(Westernblot)是70年代末在核酸印跡的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種檢測(cè)蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)技術(shù)。此法綜合了凝膠電泳高分辨率和固相免疫敏感、特異等多種優(yōu)點(diǎn),不僅可以對(duì)蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行定性、半定量分析,而且可以從混雜蛋白質(zhì)中檢測(cè)特定的抗原并測(cè)定其分子質(zhì)量,適合于變應(yīng)原特性成分的分析,尤其適用于主要變應(yīng)原及次要變應(yīng)原的檢測(cè)。孫秀珍等用免疫印跡法對(duì)葎草花粉過敏性哮喘患者血清進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量100、76、35、28、8ku的蛋白是葎草花粉過敏性哮喘患者的致敏成分。本研究對(duì)法國梧桐花粉變應(yīng)原的免疫印跡分析表明,有4條蛋白帶能與梧桐花粉特異性IgG結(jié)合,其分子質(zhì)量為50、39、22、16ku,說明梧桐花粉含有多種致敏成分。自1996年Ishizaka等發(fā)現(xiàn)IgE后,它一直被認(rèn)為是介導(dǎo)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的主要抗體。近年來,不少研究發(fā)現(xiàn)血清免疫球蛋白IgG參與Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),起著過敏性抗體的作用(主要是IgG4)。Etievant等在屋塵螨脫敏治療的哮喘患者中發(fā)現(xiàn)IgG4降低者癥狀緩解。Nahm等測(cè)定塵螨過敏性哮喘