實(shí)用文檔PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)；2.掌握群體遺傳學(xué)基因頻率與基因型頻率的計(jì)算方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】1. 凝膠電泳是分離、鑒定、純化及制備DNA片段最常用的方法，可分為兩類，一類是瓊脂糖凝膠電泳，適用于lkb和大于lkb以上DNA；另一類是聚丙烯酰胺凝膠電泳，適用于小于lkb的DNA。瓊脂糖凝膠電泳是一種簡便易行的分離、純化和鑒定DNA片段的方法。分為水平板和垂直板兩種，一般采用水平電泳。2. 瓊脂糖凝膠在DNA分子泳動(dòng)時(shí)兼有“分子篩”和“電荷”的雙重作用。3. DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動(dòng)。4. 由于瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此電泳時(shí)，帶電顆粒的分離速度不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小。5. 由于實(shí)驗(yàn)中相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以同樣的速度向正極移動(dòng)。6. 相對(duì)分子質(zhì)量小者泳動(dòng)快，大的泳動(dòng)慢。7.溴化乙錠是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的DNA熒光染料，含有一個(gè)可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)，它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合DNA的染料高出20-30倍。所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠（0.5μg/mL）時(shí)，可以檢測到少至10ng的DNA條帶8.TBE（成分：Tris，EDTA，硼酸，蒸餾水）的作用：a.穩(wěn)定體系酸堿度（正負(fù)極氧化還原反應(yīng)，使正極變酸、負(fù)極變堿性）b.使溶液具有導(dǎo)電性，以利于DNA分子的遷移c.其中的EDTA螯合鎂離子，防止電泳時(shí)激活DNA酶9.引物二聚體:引物二聚體是引物的3’端間相互錯(cuò)配擴(kuò)增形成的。引物二聚體的出現(xiàn)是必然的，只是或多或少的問題，電泳時(shí)看不到引物二聚體帶也不代表沒有二聚體出現(xiàn)，只是含量低我們的肉眼看不到而已。優(yōu)化PCR的實(shí)驗(yàn)條件(包括提高退火溫度，降低引物濃度等)可大大降低二聚體的濃度。11.LoadingBuffer指示劑溴酚藍(lán)，可以顯示電泳的進(jìn)程；甘油成分增加樣品密度，是樣品密度大于電泳緩沖液，防止樣品飄出點(diǎn)樣孔。【實(shí)驗(yàn)過程及注意事項(xiàng)】（實(shí)驗(yàn)所用試劑及其作用）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備器材離心機(jī)、離心管、記號(hào)筆、移液器、移液器吸頭、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、紫外透射箱等。試劑0.5XTBE、上樣緩沖液（loadingbuffer）、瓊脂糖、溴化乙錠、DNAmarker等。材料PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。1.制備瓊脂糖凝膠：用1%TBE150ml緩沖液（1×TBE）溶解2.25g瓊脂糖，放入三角瓶中，微波爐加熱煮沸(注意搖動(dòng)時(shí)避免產(chǎn)生氣泡)，待瓊脂糖完全溶解后，冷卻至60℃(不燙手)，加10ulEB，混勻、倒膠。2.制板：將膠倒入制膠板內(nèi)，室溫下充分凝固(約2h），豎直拔下梳子。將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入緩沖液，沒過膠面1~2mm。3.點(diǎn)樣：（上樣時(shí)要輕、穩(wěn)、準(zhǔn)、快）注意：1%TBE緩沖液沒過膠面1~2mm，用移液器小心加入10ulPCR產(chǎn)物，留出5ulMarker的位置。4.電泳：接通電源，注意電極方向，電泳約25分鐘。5.觀察：取下瓊脂糖凝膠，放置在紫外投射箱中觀察。6.分析。注意事項(xiàng)1.電泳通常選擇直流電源，電壓在1-2V/cm，在25℃左右的室溫中進(jìn)行。2.溫度過高會(huì)加速DNA分子擴(kuò)散，使條帶變寬、模糊。3.注意每個(gè)上樣孔的載樣量，太少會(huì)使條帶不明顯；太多則會(huì)造成條帶拖尾。4.EB可以嵌入堿基分子中，導(dǎo)致錯(cuò)配。許多人認(rèn)為溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑,具有高致癌性。不可以直接接觸。5.拔梳子時(shí)候要垂直拔出?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與討論】（上傳瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖片，是否得到電泳條帶，并說明原因）本人得到了電泳條帶,本班電泳條帶比例為II型13人，ID型11人，DD型9人。本班內(nèi)：I的基因頻率為（13*2+11）/66=0.56;D的基因頻率為0.44部分人沒有得到條帶，可能是以下原因：1上樣液發(fā)生擴(kuò)散飄移，而擴(kuò)增濃度達(dá)不到，電泳結(jié)果不明顯。2.DNA提取量太少，眼科剪未剪碎棉簽頭部，導(dǎo)致棉簽頭部過大，離心后吸取DNA提取液（上清液），造成了DNA提取液量比較少；3.也有可能是棉簽刮擦力度不夠，導(dǎo)致未得到電泳條帶瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖【思考題】某研究小組調(diào)查了某地區(qū)1000名無關(guān)個(gè)體ACE基因I/D的多態(tài)性分布，其中608名為II基因型，ID基因型個(gè)體的基因型頻率為0.32，DD基因型個(gè)體38人，50人未檢出，計(jì)算等位基因I與D的基因頻率。50人未檢出，即實(shí)際檢出950人故：ID基因型人數(shù)：0.32*950=304人基因頻率:群體中等位基因D的頻率：p=(38x2+304)/1900=0.20群體中等位基因I的頻率：q=(608x2+304)/1900=0.80答