基因重組和基因工程

GeneticbinationandGeneticEngineering第十四章目錄目的和要求掌握基因重組與基因工程的基本原理及基本概念。理解細菌中的基因轉移和重組熟悉工具酶，特別是限制性核酸內切酶及其特點，DNA克隆的一般步驟了解重組DNA技術與醫(yī)學的關系。

本章主要內容一、DNA的重組二、DNA重組技術三、DNA重組技術與醫(yī)學的關系第一節(jié)

DNA的重組

DNAbination

DNA重組的類型轉座重組((transposition)同源重組(homologousbination)特異位點重組(site-specificbination)細菌的基因轉移與重組一、同源重組(bination)

發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是自然界最基本的DNA重組方式二、細菌的基因轉移與重組（一）接合作用（二）轉化作用（三）轉導作用（一）接合作用(conjugation)。當細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細菌轉移至另一細菌，這種類型的DNA轉移稱為接合作用。（二）轉化作用通過自動獲取或人為的供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用

(transformation)。

λ噬菌體的生活史溶源生長途徑(lysogenicpathway)溶菌生長途徑(lysispathway)例目錄（三）轉導作用DNA的復制蛋白質外殼的合成溶菌、釋放溶菌生長途徑溶源生長途徑溶源生長途徑當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（受體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用(transduction)。三、位點特異重組(site-specificbination)

由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合重組四、轉座重組(transposition

bnition）由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座。第二節(jié)

重組DNA技術DNAbinationTechnique重組DNA技術的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗1972年美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子1976年美國南舊金山建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了“多莉”一、重組DNA技術相關概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。（一）DNA克隆獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。技術水平：動物或植物（個體克?。┘毎寺》肿涌寺?molecularclone)

即DNA克隆

DNA克隆將目的片段與載體連接并導入宿主細胞。使目的片段在宿主細胞中不斷進行增殖。最后用適當的方法收集這些DNA片段，就獲得了該DNA的克隆。又稱基因克隆或重組DNA(binantDNA)。生物技術工程:

基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。（二）工具酶

限制性核酸內切酶

T4DNA連接酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉錄酶堿性磷酸酶末端轉移酶

TaqDNA聚合酶

限制性核酸內切酶發(fā)現(xiàn)：來源：細菌定義:限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ

屬種株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切割產生的末端：平端、粘端GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGG3'CCTAG55'GATCC'

'3G+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端粘端同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)

指反轉錄合成的、與RNA互補的單鏈DNA。定義：人們感興趣的基因或DNA序列。RNAcDNA基因組DNA(genomicDNA)（四）基因載體定義：為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。

質粒DNA

病毒DNA

噬菌體DNA

可充當載體的DNA：

克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。載體的選擇標準能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。1.質粒

(plasmid)特點能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。pBR322的物理圖譜能自主復制具有amprterr有克隆位點λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

插入型置換型外源片斷M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ'基因）M13mp系列pUC系列酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）其他二、重組DNA技術基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)

（見第22章）*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉錄酶載體受體菌復制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構建BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BglⅡ切割GATCTAGATCTAGATGATCGATCTAGATCTAGATGATC不同限制酶切位點連接2.平端連接適用于：限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄3.同聚物加尾連接在末端轉移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。

人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式轉化(transformation)轉染(transfection)

：感染(infection):以噬菌體為載體，在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，使其感染受體菌。（四）重組DNA導入受體菌（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)

抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法Southern印跡

2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等(插入失活法)抗藥性標記選擇目錄BamHI組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救目錄α互補的檢測目錄Southern印跡重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉轉入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術動畫表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產物的分離純化（六）克隆基因的表達1.原核表達體系（E.coli表達體系最為常用）標準：選擇標志 強啟動子翻譯調控序列多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足

不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

很難表達大量可溶性蛋白E.coli優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區(qū)域積累缺點：操作技術難、費時、不經濟2.真核表達體系

酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞家蠶（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據基因定位克隆之并研究其性質，而認識疾病的分子機制。三、重組技術與醫(yī)學的關系（二）生物制藥

重組DNA醫(yī)藥產品產品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂目錄基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學及分子遺傳的技術和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過程區(qū)分或鑒定DNA的異常分離、擴增待測的DNA片斷基因治療(genetherapy)是向有功能缺陷的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。方式：體細胞基因治療性細胞基因治療（四）基因治療1.產前診斷2.攜帶者測試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性（五）遺傳疾病的預防生物新聞10月11日我國科學家11日對外宣布，他們已經成功繪制完成第一個完整中國人基因組圖譜(又稱“炎黃一號”)，這也是第一個亞洲人全基因序列圖譜。專家表示，這項在基因組科學領域里程碑式的科學成果，對于中國乃至亞洲人的DNA、隱形疾病基因