扁穗牛鞭草花粉管萌發(fā)的觀察

水稻科植物是水稻科植物的一種多年生根草本植物。它在中國(guó)西南的無性繁殖和灌溉。根據(jù)對(duì)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)1986年育成的‘廣益’(H.compressacv.Guangyi)和‘重高’(H.compressacv.Chonggao)扁穗牛鞭草品種多年觀測(cè),發(fā)現(xiàn)這2個(gè)品種在野生狀態(tài)和人工栽培條件下結(jié)實(shí)率很低,“花而不實(shí)”一直是困惑扁穗牛鞭草研究者的難題。生產(chǎn)上廣泛使用的扁穗牛鞭草品種均由無性系選擇產(chǎn)生,也多采用無性繁殖的方式進(jìn)行擴(kuò)繁,由此限制了扁穗牛鞭草的進(jìn)一步推廣。目前南方地區(qū)的人工草地建植及生態(tài)恢復(fù)重建都選擇該草種作為主打草種,但無性繁殖耗費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力,給實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用帶來了困難,生產(chǎn)上迫切需要扁穗牛鞭草種子,同時(shí)提高結(jié)實(shí)率也是品種改良的關(guān)鍵。目前對(duì)該資源的研究主要集中在生態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等方面,對(duì)其孢粉學(xué)的專項(xiàng)研究成果尚未見報(bào)道。為此,本試驗(yàn)欲從花粉形態(tài)、花粉活力、花粉萌發(fā)等方面進(jìn)行研究,探索‘廣益’扁穗牛鞭草結(jié)實(shí)率低的原因,旨在為扁穗牛鞭草育種研究提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)單元和樣品1.1.1土壤條件、濕度試驗(yàn)地位于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系基地(北緯38°8′,東經(jīng)103°14′,海拔600m),屬北亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū)。年均氣溫16.2℃,最熱月(7月)均溫25.3℃,最冷月(1月)均溫6.1℃,極端最高氣溫37.7℃,年降水量1774.3mm,年蒸發(fā)量1011.2mm,相對(duì)濕度79%,年日照時(shí)數(shù)1039.6h,年無霜期304d,≥10℃年積溫5231℃。試驗(yàn)地土壤系白堊紀(jì)灌口組紫色沙頁巖風(fēng)化的堆積物形成的紫色土,土壤有機(jī)質(zhì)含量14.62g/kg,全氮含量1.91g/kg,全磷含量0.06g/kg,全鉀含量11.58g/kg,速效氮含量100.63mg/kg,速效磷含量4.73mg/kg,速效鉀含量338.24mg/kg,pH值6.2。試驗(yàn)期間,試驗(yàn)區(qū)最高氣溫(8月中旬)29.04℃;最大濕度和平均濕度(9月下旬)分別為98.33%和76.92%;最大降水量36.16mm。1.1.2試驗(yàn)材料于2006年采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系種植3年的‘廣益’扁穗牛鞭草草地,在其開花期間取小穗進(jìn)行相關(guān)觀測(cè)。1.2測(cè)試方法1.2.1花粉的x射線檢測(cè)在7-11月整個(gè)開花期間,采含苞待放的花直接投入戊二醇溶液進(jìn)行固定。集花粉標(biāo)本,對(duì)其進(jìn)行干燥前處理。將處理后的花粉樣品均勻地撒在載物臺(tái)上的雙面膠紙上,然后經(jīng)鍍膜機(jī)鍍膜。把樣品置入KYKY1000B-掃描電子顯微鏡,選擇不同放大倍數(shù),不同觀察角度,對(duì)花粉群體、極面、赤道面、溝間區(qū)和萌發(fā)孔進(jìn)行觀察和攝影,并對(duì)其形態(tài)特征要點(diǎn)、各種技術(shù)參數(shù)進(jìn)行必要的記載。利用顯微攝影后獲得的掃描照片,對(duì)每種花粉進(jìn)行體積大小的測(cè)量,對(duì)表面紋飾、萌發(fā)孔結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征分別進(jìn)行描述。有關(guān)花粉粒表面性狀的所有數(shù)據(jù)均來源于20?；ǚ鄣钠骄怠?.2.2花粉粒的測(cè)定采用碘染色法測(cè)定不同花序同一部位上即將開放的小花花粉活力。隨機(jī)取10個(gè)花藥于載玻片上,加1滴蒸餾水,用鑷子充分搗碎后滴加1或2滴I2-KI溶液染色,用德國(guó)生產(chǎn)的LeicaDM5000B顯微鏡觀察花粉粒著色情況,花粉粒完全被染成深藍(lán)色作為有活力花粉粒。每個(gè)花位的小花制片10張,每張片觀察3~5個(gè)視野。統(tǒng)計(jì)1個(gè)視野中花粉粒的總數(shù)和已染色的花粉粒數(shù),計(jì)算每個(gè)花位觀察視野所得到的總數(shù),按下式計(jì)算各花位小花的花粉生活力:花粉生活力(%)=被染色花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù)×100%。1.2.3樣品處理和掃描電鏡2006年夏季,在17∶00點(diǎn)左右采集尚未開放的小花,進(jìn)行人工自花授粉后,1,2,3,4和5h各取樣1次,然后將完整的柱頭、花柱和子房一起剝離,材料置于卡諾固定液(酒精∶冰乙酸=3∶1),固定24h,70%酒精保存?zhèn)溆?。蒸餾水沖洗數(shù)次。轉(zhuǎn)入8mol/LNaOH溶液,在25℃過夜使組織軟化,徹底沖洗去堿后,在0.1%苯胺藍(lán)(0.1mol/LK3PO4,pH值12.4)中染色35min,緩沖液洗3或4次,共30min,1%鋨酸再固定2h后用H3PO4緩沖液沖洗,30%,50%,70%,80%,90%和100%乙醇逐級(jí)脫水,每級(jí)15min,脫水后的樣品放入醋酸異戊酯中置換過夜,在HCP-2型臨界干燥器內(nèi)進(jìn)行干燥,用離子噴射儀真空噴金,在KYKY1000B-掃描電子顯微鏡下觀察并照相。每處理觀察計(jì)數(shù)10枚雌蕊。1.2.4自然傳粉實(shí)當(dāng)田間種植的‘廣益’扁穗牛鞭草果穗成熟后,采回室內(nèi),統(tǒng)計(jì)開花總數(shù)和結(jié)實(shí)數(shù)(剝離檢查),計(jì)算其自然傳粉結(jié)實(shí)率:結(jié)實(shí)率(%)=結(jié)實(shí)數(shù)/開花數(shù)×100%。2結(jié)果2.1群體形態(tài)觀察在光學(xué)顯微鏡下觀察扁穗牛鞭草的花粉粒,粒大飽滿的圓形花粉粒能夠被I2-KI溶液染成黑色或深藍(lán)色,表明其生活力較強(qiáng)。未著色的花粉粒呈金黃色,通常是小圓粒和癟粒,癟粒有多種形狀,如橢圓形、三角形、不規(guī)則的多邊形等。在掃描電子顯微鏡低放大倍數(shù)(400倍)下觀察花粉粒群體形態(tài),花粉粒為單粒,形態(tài)各有差異,有干癟的畸形花粉粒存在(圖1a)。正常的花粉粒通常呈球形或橢球形,具有較光滑的外壁紋飾,稍有起伏,個(gè)體大小近似。花粉粒近球形或扁球形,極面觀(P)變幅25.9~38.2μm,赤道面(E)變幅24.12~34.71μm,平均大小(P×E)32.2μm×29.24μm。單孔(遠(yuǎn)極孔),孔明顯,圓形或橢圓形,極面觀變幅3.3~4.7μm,赤道面變幅2.3~3.8μm,萌發(fā)孔大小3.8μm×2.9μm,具孔環(huán)、孔帽,孔環(huán)內(nèi)緣比較整齊,孔蓋較小,形狀不規(guī)則,孔蓋表面為較大的顆粒狀紋飾,孔環(huán)微外突?；ǚ哿１砻鏋轭w粒狀紋飾,顆粒大小不等,粗糙,分布較均勻(圖1b,c)。除部分干癟畸形花粉粒外,‘廣益’扁穗牛鞭草花粉形態(tài)、表面雕紋及萌發(fā)孔等,與其他禾本科植物花粉形態(tài)相似。2.2花粉活力與花粉?；盍乃氲捻敳克闫?第1節(jié)位小花記作第1朵小花。經(jīng)調(diào)查統(tǒng)計(jì),1枝完整的扁穗牛鞭草花序通常含小花33~43朵,平均為37朵,第1~33朵小花的平均花粉活力為29.96%,其中有柄小花花粉活力為29.72%,無柄小花花粉活力為30.21%。扁穗牛鞭草花粉活力以頂部最高,第1朵小花活力可以達(dá)到74.05%;向下活力開始降低,到中部的第16和第18朵小花達(dá)到最低,均低于8.00%;再向下活力開始上升,并趨近于平均活力(表1),這與吳彥奇和杜逸報(bào)道的“其基部第8或9小花以下的花粉粒全部無活力”有差別。該試驗(yàn)結(jié)果可能受扁穗牛鞭草種植年限、當(dāng)年氣候因素及花粉采集時(shí)期的影響,有關(guān)外界環(huán)境條件對(duì)花粉活力影響尚需要進(jìn)一步研究。2.3自交不親和性特征適宜環(huán)境條件下,花粉在柱頭上萌發(fā),然后長(zhǎng)出花粉管插入柱頭。授粉后1,2,3,4和5h,花粉萌發(fā)率隨著花粉粒在柱頭上停留時(shí)間的增長(zhǎng)而提高。授粉1h后花粉萌發(fā)很快,3h后大量花粉管進(jìn)入柱頭表面的乳突細(xì)胞,花粉管生長(zhǎng)無任何異?，F(xiàn)象,4h后花粉萌發(fā)率超過60%,反映出授粉時(shí)間長(zhǎng)短與花粉管萌發(fā)狀況有一定的關(guān)聯(lián)。但總趨勢(shì)是花粉萌發(fā)率不高,授粉5h后發(fā)芽率僅為62.39%。隨授粉時(shí)間延長(zhǎng),花粉管增長(zhǎng)。但在授粉1h內(nèi)花粉管增長(zhǎng)速度最快,為14.1μm/h,以后的增長(zhǎng)速度減緩,為1.3~3.9μm/h(表2)。以自花授粉材料觀察花粉與柱頭的相互識(shí)別情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在自花授粉后,因相同基因型的花粉在柱頭上表現(xiàn)出一定的不親和現(xiàn)象,有的與乳突細(xì)胞接觸不緊密,有的即使伸入柱頭乳突細(xì)胞,花粉管幾乎都有分叉、破裂(圖1d),證明‘廣益’扁穗牛鞭草存在自交不親和性。另外還觀察到,花粉在柱頭上附著量很少,即使有花粉附著,花粉萌發(fā)遲,花粉管不伸入柱頭乳突細(xì)胞,盤繞在柱頭表面(圖1e),或花粉管扭曲膨大(圖1f),甚至呈萎縮狀態(tài)。從觀測(cè)結(jié)果看,廣益‘扁穗牛鞭草自交不親和主要表現(xiàn)為以下3種類型:1)花粉不能萌發(fā);2)花粉能萌發(fā),花粉管盤繞在柱頭表面,不能進(jìn)入;3)花粉能萌發(fā),花粉管畸形或破裂,從而影響受精和結(jié)實(shí)。a:‘廣益’扁穗牛鞭草畸形花粉粒萌發(fā)GerminationofabnormalpollenofH.compressa.b:‘廣益’扁穗牛鞭草花粉粒的赤道面觀Pollen’sequatorialviewofH.compressa.c:‘廣益’扁穗牛鞭草花粉粒萌發(fā)孔Pollen’germinalapertureofH.compressa.d:花粉管進(jìn)入乳突細(xì)胞,但尖端分叉Pollentubesenteringintopapillatebuttipsbursting.e:花粉萌發(fā)后盤繞在柱頭表面Pollenbindingtoandtwingingonthesurfaceofstigmaaftergermination.f:花粉萌發(fā)后花粉管尖端膨大Pollengerminationbuttipsoftubesinflation2.4穎果的枝條形態(tài)對(duì)取回室內(nèi)的4889枚成熟果穗進(jìn)行剝離檢查,共發(fā)現(xiàn)穎果57粒,其自然傳粉結(jié)實(shí)率為1.17%。沒有結(jié)成穎果的果穗幾乎都可以發(fā)現(xiàn)枯萎的雌蕊,說明極低的結(jié)實(shí)率與生殖生理等因素有關(guān),與穎果是否脫落等物理原因無關(guān)。扁穗牛鞭草進(jìn)入結(jié)實(shí)期后,花序上、下部的穎果成熟時(shí)間極不一致,花序軸干脆易折,統(tǒng)計(jì)每個(gè)花位結(jié)實(shí)數(shù)目非常困難,給穎果的收集工作帶來不便。3‘廣益’排穗牛鞭草花粉的形態(tài)特征扁穗牛鞭草在長(zhǎng)期的自然選擇和人類不自覺的選擇下,無性繁殖方式在生產(chǎn)上已被默認(rèn),以至延續(xù)至今,這可能是造成其結(jié)實(shí)率低的主要原因之一。由于其強(qiáng)大的橫走根莖能夠很快在地面長(zhǎng)出新的植株,新的植株又能迅速向周圍蔓延,在地上形成了嚴(yán)密的覆蓋層,這就造成了扁穗牛鞭草產(chǎn)生的種子不易下土,即使下土后也很難長(zhǎng)出新的植株。同時(shí),利用這種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草也是在持續(xù)放牧或適時(shí)刈割時(shí),幾乎不會(huì)等到其開花結(jié)實(shí),這些都在無意識(shí)中加速了對(duì)其種子繁殖生殖方式的淘汰,使其更加適應(yīng)于無性繁殖。Heslop-Harrison指出牧草花粉在結(jié)構(gòu)和功能上具有不同程度的特異性,花粉是否具有育性及其活力的強(qiáng)弱都將可能影響結(jié)實(shí)的成敗;并且花粉粒的形態(tài)特征符合遺傳的穩(wěn)定性和多樣性規(guī)律,完全可以反映科、屬、種間的一致性及差異。禾本科植物的花粉粒均為圓球形,單孔,顆粒狀紋飾,而在種間存在著性狀細(xì)節(jié)中的差異?；ǚ鄣难莼厔?shì)為舟形→縱長(zhǎng)形(單溝)→球形→扁球形(具溝)→扁球形或圓球形→長(zhǎng)球形。花粉的表面紋飾演化趨勢(shì)為表面光滑→表面條紋狀、網(wǎng)狀→表面疣狀、刺狀等。依據(jù)上面的觀點(diǎn),從‘廣益’扁穗牛鞭草花粉的外觀形態(tài)、外表紋飾等特征推斷,除干癟粒以外,其花粉粒具有比較進(jìn)化的外觀特征,基本屬于正常粒。此外,已萌發(fā)的花粉粒中也有干癟現(xiàn)象出現(xiàn),這可能是其自身遺傳作用的結(jié)果,也可能是后天氣候條件甚至是營(yíng)養(yǎng)條件所致。電鏡掃描觀測(cè)研究結(jié)果表明,‘廣益’扁穗牛鞭草自交不親和與萌發(fā)的花粉管有許多異?，F(xiàn)象有關(guān)。有研究認(rèn)為提出自交不親和是由S基因控制,但植物生殖過程是復(fù)雜的,‘廣益’扁穗牛鞭草自交不親和的遺傳機(jī)制也是復(fù)雜多樣的,可能存在2種或2種以上遺傳機(jī)制同時(shí)在起作用,這需要進(jìn)一步研究。關(guān)于花粉管在花柱中破裂的現(xiàn)象,與外界溫度和花柱內(nèi)不適合的滲透壓有關(guān),因而不能受精。在遠(yuǎn)緣雜交情況下,發(fā)生花粉管破裂更是常有的現(xiàn)象。在所有這些情況下,花粉管的破裂是一種生物學(xué)上不適應(yīng)的表現(xiàn),其后果是導(dǎo)致部分或完全的不孕。目前有大量文獻(xiàn)表明花粉管破裂有其積極的生物學(xué)意義,花粉管泄出的內(nèi)含物對(duì)雌蕊組織和正在發(fā)育的幼胚有深刻影響,并能促進(jìn)相鄰花粉萌發(fā)和生長(zhǎng)?！畯V益’扁穗牛鞭草不結(jié)實(shí)顯然與花粉管的破裂有一定關(guān)系,但是盡管‘廣益’扁穗牛鞭草結(jié)實(shí)率相當(dāng)?shù)?受精作用仍然可以成功完成,精核來源于自花還是異花尚需研究。另外,‘廣益’扁穗牛鞭草花柱中生長(zhǎng)的花粉管及其流出的內(nèi)含物中,含有許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì),這些物質(zhì)是積極參與雌蕊的代謝從而影響受精與胚胎發(fā)育,或僅是無謂的消耗,尚需用試驗(yàn)驗(yàn)證?；ǚ刍盍ζ鸵彩窃斐杀馑肱１薏萁Y(jié)實(shí)困難的原因之一,并且不同花位花粉活力不同。位于花序頂部的小花花粉活力較高,可能是由于頂端優(yōu)勢(shì),使其有充分的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和時(shí)間來完成生理成熟,育性較高。而中部的小花在成花過程中既要面臨上部小花開花對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要,又要面對(duì)下部小花抽穗及成花對(duì)營(yíng)養(yǎng)的爭(zhēng)奪,所以育性普遍偏低?；啃』ㄓ捎谖挥谶\(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的花序軸基部,在營(yíng)養(yǎng)的獲得上明顯更占有優(yōu)勢(shì),所以其花粉生活力較中部小花有一定的提高?！畯V益’扁穗牛鞭草花器官的正常發(fā)育、授粉和受精在其繁殖中是最重要也是關(guān)鍵的過程,對(duì)這些復(fù)雜生理過程的研究也顯得迫切。因?yàn)樗巧a(chǎn)上廣泛使用的重要草種,其危機(jī)是它不能夠產(chǎn)生正常的、能夠發(fā)芽生根的種子,這就是為什么“花而不實(shí)”是‘廣益’扁穗牛鞭草花粉研究中所面臨的最大問題。在今后的研究中,對(duì)其“花而不實(shí)”機(jī)理進(jìn)