登革熱實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜述

由于登吉熱的臨床診斷困難，實(shí)驗(yàn)室檢測對病例的診斷非常重要。登革病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)已經(jīng)發(fā)展數(shù)十年,方法眾多,針對不同的檢測時(shí)期、檢測目的,有不同的檢測方法。目前以病毒分離、血清學(xué)檢測和基因檢測為主,了解不同檢測方法的適用范圍及操作方法,進(jìn)而根據(jù)檢測標(biāo)本及檢測條件,因地制宜地選擇合適的檢測方法,實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的診斷,及時(shí)對登革熱疾病治療和疫情防控提供依據(jù)。1鄧氏熱病原學(xué)檢測1.1間接免疫熒光試驗(yàn)檢測蚊細(xì)胞和新生乳小鼠的病毒病毒分離培養(yǎng)是確證感染登革病毒的金標(biāo)準(zhǔn),不僅能確認(rèn)病毒感染,而且能區(qū)分不同的血清型。登革病毒必須在活細(xì)胞內(nèi)存活,可以通過感染活蚊、接種敏感細(xì)胞和動(dòng)物進(jìn)行分離培養(yǎng)。目前多采用胸腔接種白紋伊蚊或C6/36白紋伊蚊細(xì)胞和新生乳小白鼠(1-3日齡)分離登革病毒,根據(jù)觀察病毒對細(xì)胞或動(dòng)物產(chǎn)生的變化(病變等現(xiàn)象),應(yīng)用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測病毒的存在和型別。從患者血液、組織一旦分離出登革病毒,即可確診感染和病毒型別。盡管活細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒較最早的蚊體和鼠腦培養(yǎng)病毒方便很多,但有研究證實(shí)其在實(shí)際操作中敏感性僅為40.5%。因其對樣本要求嚴(yán)格,需要專業(yè)的操作人員和相關(guān)設(shè)備,僅能用于病毒血癥期的樣本,檢測窗口期受限,分離病毒耗時(shí)長,難以在普通實(shí)驗(yàn)尤其是基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,達(dá)不到早期快速診斷的目的,在臨床檢測中使用較少,目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室更多地采用分子生物學(xué)檢測方法取代DV病毒分離。1.2臨床應(yīng)用檢測近年來,隨著聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的廣泛使用以及登革病毒基因組序列分析成功,登革熱檢測技術(shù)已經(jīng)從傳統(tǒng)的病毒分離及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)入分子生物學(xué)檢測階段,通過核酸檢測擴(kuò)增出特異性的病毒基因,并可區(qū)分病毒血清型。登革病毒為單股正鏈RNA病毒,研究證實(shí)在登革病毒感染10天內(nèi)均可以做RT-PCR,尤其是感染6天內(nèi)檢出率較好,操作簡單,能進(jìn)行分型,適合于登革病毒的快速檢測,且RT-PCR比病毒分離具有更好的敏感度(敏感性為48.4%~98.2%),針對同一病人不同樣本進(jìn)行檢測,全血檢測敏感度為90.0%,血清或血漿相對較低(62.0%)?，F(xiàn)行的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中(WS216-2008)推薦使用RT-PCR技術(shù)檢測登革病毒RNA及TapMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。市場上均有商品化試劑盒,操作簡單易行。有研究通過比較兩種檢測方法,認(rèn)為TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR比常規(guī)RT-PCR敏感性提高了100倍,達(dá)到了0.001TCID50/mL,且檢測時(shí)間至少節(jié)約了2小時(shí),認(rèn)為TaqMan實(shí)時(shí)定量RT-PCR是一種靈敏、特異、快速、低污染的登革病毒RNA檢測方法,可定性或定量檢測登革熱患者早期血清中的登革病毒。雖然分子生物學(xué)檢測存在標(biāo)準(zhǔn)化等問題,相對病毒分離具有較高的敏感性和特異性,且操作簡單方便,已經(jīng)得到越來越多的認(rèn)可。2熱血清學(xué)2.1酶聯(lián)免疫法檢測ns1蛋白登革熱發(fā)病5日后,登革病毒隨著發(fā)熱消退而從血液中消失,愈后不產(chǎn)生病毒攜帶現(xiàn)象,這就決定了抗原檢測在早期診斷中的作用。登革病毒的抗原檢測中使用最廣泛的是檢測NS1蛋白。NS1蛋白為登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的糖蛋白,其含有2個(gè)N-連接糖基的結(jié)合位點(diǎn),高度保守,可以輔助病毒顆粒的裝配和成熟,是一種保護(hù)性蛋白。有研究發(fā)現(xiàn),酶聯(lián)免疫法檢測NS1蛋白,無論是初次感染還是二次感染,在感染后9天內(nèi)均可檢測,個(gè)別可以持續(xù)到18天。PhilippeDussart等用bio-rad的ELISA試劑盒檢測NS1蛋白,敏感性為88.7%,尤其對0-4天的樣本敏感性到87.6%而MAC-ELISAIgM抗體檢出率僅8.6%,認(rèn)為NS1蛋白檢測大大擴(kuò)大的登革熱可檢測時(shí)效,意義重大,可以用做檢測急性期登革病毒感染的一線方法。HuangCH等采用Bio-Rad公司的NS1抗原檢測試劑條對392個(gè)確診病人急性期樣本進(jìn)行檢測,陽性檢出率達(dá)68.37%,同步采用PCR檢測陽性率為71.94%,通過比較認(rèn)為登革病毒NS1抗原快速檢測試劑條是登革熱診斷的強(qiáng)有力方法,進(jìn)一步論證了急性期檢測NS1蛋白的可行性。2.2關(guān)于igg抗體抗體檢測主要是針對IgM抗體和IgG抗體,登革病毒IgM抗體在感染后3-5天即可出現(xiàn),2周達(dá)到頂峰,可持續(xù)2-3個(gè)月之久。尤其在初次感染者中IgM抗體升高明顯。IgG抗體在初次感染后10天可出現(xiàn),再次感染4天即可出現(xiàn),3W后達(dá)到峰值,并可產(chǎn)生免疫記憶。在新發(fā)感染的病例中,IgG抗體滴度往往≤1:180,再感染的病例中,IgG抗體可以迅速上升,可達(dá)1:2560,并抑制IgM抗體的滴度水平。檢測IgG抗體多采集急性期和恢復(fù)期雙份血清,如果恢復(fù)期血清比急性期血清IgG抗體滴度有4倍以上升高,即可確診感染。單份血清檢測一般表明其曾受過登革病毒感染,通過雙份血清檢測IgM抗體和IgG抗體,可以區(qū)分初次感染和再感染病例,尤其在二次感染異型的登革熱患者,發(fā)生DHF和DSS的機(jī)率較大,區(qū)分感染狀態(tài)對臨床治療意義重大。目前國際上已經(jīng)把采集急性期和恢復(fù)期雙份血清進(jìn)行IgM抗體和IgG抗體檢測作為鑒別新發(fā)感染和再感染的新標(biāo)準(zhǔn)有研究表明在初次感染后4個(gè)月,大多都檢測不到IgM抗體和IgG抗體,二次感染者在感染后10個(gè)月,仍能檢測到高滴度IgG存在。具體檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和乳膠層析法(快速法)。2.2.1間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)登革病毒IgM抗體可以應(yīng)用IgM捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Mac-ELISA)或者應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測登革病毒IgM抗體。均是根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理,檢測血清中的IgM,顯色程度和特異性IgM抗體含量呈正比。IgM抗體陽性,表示患者新近感染登革病毒,適用于登革病毒早期診斷。有研究表明此法檢測敏感性為61.5%~99.0%,特異性可達(dá)79.9%~97.8%,敏感性和特異性與樣本采集時(shí)間直接相關(guān)。IgG抗體檢測多應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測登革病毒IgG抗體或免疫熒光法(FA/IFA)檢測雙份血清IgG抗體,尤其以前者應(yīng)用較多,但其特異性相對較差,且和其他黃病毒存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng),主要通過測定雙份血清IgG抗體水平,進(jìn)而區(qū)分新發(fā)感染和再感染。2.2.2快速法檢測IgM抗體和IgG抗體登革熱的診斷及新發(fā)感染和再感染的區(qū)分對疾病的流行和病情發(fā)展意義重大,免疫層析法操作簡單方便,可以同時(shí)檢測IgM抗體和IgG抗體,有助于區(qū)分初次感染和再感染,是實(shí)驗(yàn)室檢測登革熱感染的重要方法。例如Panbio公司的快速法檢測試劑,可以同時(shí)檢測IgM抗體和IgG抗體,對IgG抗體檢測采用半定量方式,只有在血清中IgG抗體滴度≥1:2560時(shí)才會(huì)顯色呈陽性反應(yīng),借此來區(qū)分二次感染。快速檢測試劑條的使用,大大提升了實(shí)驗(yàn)室尤其是基層實(shí)驗(yàn)室檢測登革熱的能力,并能區(qū)分新發(fā)感染和二次感染對疾病的診治及疫情估計(jì)意義重大。相對于ELISA檢測的繁瑣步驟,快速法檢測能更加快捷及時(shí)。雖然普遍認(rèn)為快速法檢測敏感性(20.5%~97.7%)和特異性(76.6%~90.6%)較ELISA法均低,但JoséRubensCostaLima等用panbio試劑檢測1156份疑似登革熱樣本,發(fā)現(xiàn)快速法的陽性檢出率為40%,IgM-ELISA法陽性檢出率為42%,認(rèn)為兩者無明顯區(qū)別,快速法是一種可靠的檢測方法。和其他檢測方法一致,分析層析法檢測的敏感性和特異性檢測中,樣本采集時(shí)間對結(jié)果影響重大,不同公司試劑條原理相同,敏感性、特異性略有不同。2.2.3象能被抑制試驗(yàn)登革病毒具有血凝活性,pH和溫度被控制在適當(dāng)?shù)臈l件下,登革病毒能使鵝、雞、鴿及綿羊紅細(xì)胞發(fā)生凝集,而在特異性抗體存在的情況下這種凝集現(xiàn)象能被抑制,即血凝抑制(HI)試驗(yàn)?？梢杂脕矸诸惓醮胃腥竞驮俑腥?。初次感染后5-6天即可檢測到抗體,但滴度一般都小于1:640,再感染當(dāng)天即可檢測到較高的抗體水平(大于1:1280)。WHO曾把HI作為登革熱的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法,但HI檢測需要雙份血清,試劑和操作不易標(biāo)準(zhǔn)化,不能確定病毒的血清型,與其他B組蟲媒病毒成員存在交叉反應(yīng),缺乏特異性,因此已經(jīng)逐漸被IgM抗體、gG抗體檢測等快速診斷方法所取代。2.2.4失去感染的能力當(dāng)人體感染登革病毒后,血清中可產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體,登革病毒與這種特異性抗體作用后,能被特異性的中和,進(jìn)而抑制病毒的復(fù)制和繁殖,使其失去感染能力。動(dòng)物中和試驗(yàn)由于對試驗(yàn)條件的特殊要求,一般的實(shí)驗(yàn)室很難做到,所以更多的實(shí)驗(yàn)室采用的是組織培養(yǎng)中和試驗(yàn)和空斑減少中和試驗(yàn)。中和反應(yīng)試驗(yàn)在血清學(xué)檢測種具有較好的敏感性和特異性。但是該方法價(jià)格昂貴,耗時(shí)長,對操作人員要求高,因此該試驗(yàn)的應(yīng)用受到限制,目前應(yīng)用較少。2.2.5gm抗體間交叉試驗(yàn)斑點(diǎn)免疫于20世紀(jì)末開始應(yīng)用于登革熱病例檢測,研究表明,DIBA用于檢測登革病毒IgM抗體,敏感性較高,結(jié)果判讀容易,但和其他黃病毒屬病毒及蟲媒傳染病之間存在嚴(yán)重交叉反應(yīng),且操作復(fù)雜,成本相對較高,不適合用于初篩實(shí)驗(yàn)。而DIBA用于檢測DV-IgG抗體比HI及IFA具有更高的敏感性和特異性,可作為登革病毒感染的確證實(shí)驗(yàn)。3pcr和ns1檢測結(jié)果登革病毒感染后,體內(nèi)各抗原抗體出現(xiàn)時(shí)間不同,可以分為兩個(gè)階段,根據(jù)不同階段選擇不同的檢測靶標(biāo)。第一階段:感染早期即發(fā)熱期和病毒血癥期,該階段可進(jìn)行病原學(xué)檢測(病毒分離和基因檢測)和NS1抗原檢測。尤其是發(fā)病后5d內(nèi),進(jìn)行PCR和NS1檢測效果肯定。目前有針對PCR檢測已有成熟的商品化試劑盒,NS1蛋白檢測可以采用酶聯(lián)免疫法和乳膠層析法。第二階段為熱退后體內(nèi)抗體出現(xiàn)期,IgM抗體在發(fā)病5d后即可出現(xiàn),2周達(dá)到高峰,可持續(xù)90天。IgG抗體在初次感染者中出現(xiàn)晚于IgM抗體,一般與發(fā)病10天左右出現(xiàn),并將長期存在;再次感染中,IgG抗體因免疫記憶可迅速出現(xiàn),急劇升高。根據(jù)各抗體出現(xiàn)時(shí)間,采集急性期和恢復(fù)期雙份血清進(jìn)行綜合判斷,對診斷意義重大?？梢赃x擇乳膠層析法(快速法)或酶聯(lián)免疫法進(jìn)行IgM抗體和IgG抗體檢測,市場上有比較成熟的商品化試劑盒可供選擇。4檢測方法的選擇登革熱實(shí)驗(yàn)室診斷已經(jīng)有數(shù)十年的發(fā)展歷程,目前可進(jìn)行多種方法進(jìn)行檢測,針對不同的條件和樣本,需要選擇適合的方法。病毒分離、血凝抑制及中和試驗(yàn),由于操作復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻,耗時(shí)長,使用受限。PCR檢測及抗原和抗體檢測是目前使用廣泛的方法。StartD.Blacksell等對3大試劑盒生產(chǎn)商的7種商品化登革熱酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行了比較,分別為SD公司和Panbio公司的NS1、MAC-IgM、IgGELISA試劑盒以及Bio-Rad公司的NS1ELISA試劑盒,對239個(gè)登革熱陽性病人急性期和恢復(fù)期雙份血清共478份樣本和98例陰性病例進(jìn)行檢測,認(rèn)為NS1蛋白抗原檢測和IgM抗體檢測均可作為急性期檢測方法,通過比較不同檢測方法,各試劑的敏感性和特異性存在差異,且對不同血清型的樣本各試劑盒的陽性檢出率不同,如panbio公司的MAC-IgMELISA試劑盒,對1型登革熱陽性樣本的檢出率為91%,而對4型登革熱陽性樣本的檢出率相對較低為70%。無論是檢測NS1抗原還是IgM抗體,單一的檢測均存在缺陷,而通過NS1和IgM抗體聯(lián)合應(yīng)用則可以獲得理想的敏感性和特異性檢測。另外文章指出panbio的IgG抗體檢測采用半定量的方法可以達(dá)到區(qū)分新發(fā)感染和再感染的目的,但單一的IgG抗體檢測對急性期病人的診斷價(jià)值不大。BlacksellSD等通過對6種快速法登革熱檢測試劑進(jìn)行對比后,認(rèn)為快速法檢測尤其適合少量樣本的快速檢測,采用抗原抗體檢測組合的方式效果肯定,如采用SD公司的NS1抗原和IgM抗體雙重檢測,敏感性和特異性可達(dá)到93%、89%。HuangCH等采用Bio-Rad公司研制的NS1抗原檢測試劑條對392個(gè)樣本進(jìn)行檢測,NS1抗原檢測試劑條的檢出率為68.37%,同時(shí)PCR的檢出率為71.94%。認(rèn)為早期樣本(0-3天)檢測中,PCR和NS1試劑條的雙重檢測敏感性高,較晚期的樣本(4-8天)采用ELISA法檢測IgM/IgG抗體和NS1試劑條的組合方法效果理想,可以達(dá)到90%以上的診斷。趙珠