型登革病毒在kmb17上的適應(yīng)性培養(yǎng)及增殖動(dòng)態(tài)研究

病毒位于真菌病毒科，屬于黃毒科黃色病毒科。它主要通過埃及蚊和白紋蚊傳播，導(dǎo)致真菌病毒（df）、發(fā)病率高、死亡率高的登甲出血熱（dhf），以及登甲休克綜合征（sds）。病毒在蚊體內(nèi)以及白紋伊蚊傳代細(xì)胞(C6/36細(xì)胞)、猴腎、地鼠腎原代和傳代細(xì)胞中能增殖,并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。病人及隱性感染者是本病的主要傳染源,而叢林中的靈長類是維護(hù)病毒在自然界循環(huán)的動(dòng)物宿主。迄今為止全球仍沒有獲準(zhǔn)上市的登革病毒疫苗,目前最有潛力的傳統(tǒng)減毒活疫苗候選株是由泰國沃特瑞德研究所(WRAIR)研發(fā)的以犬腎細(xì)胞和恒河猴胚肺細(xì)胞為基質(zhì)的疫苗,Vero細(xì)胞也被認(rèn)為是疫苗開發(fā)的候選基質(zhì),以人源性細(xì)胞制備的登革疫苗候選株還未見報(bào)道。因此研究登革病毒在人源性細(xì)胞上的適應(yīng)性對于登革病毒疫苗的研發(fā)具有重要意義。人胚肺二倍體細(xì)胞株KMB17由醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所建立并擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán),作為人源性細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)人用疫苗時(shí),引入的外源因子較少,比動(dòng)物來源的細(xì)胞基質(zhì)具有更好的安全性,且能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模疫苗生產(chǎn),已經(jīng)成功應(yīng)用于甲肝疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗的生產(chǎn)。本研究將Ⅲ型登革病毒中國株D9964在人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17上培養(yǎng)適應(yīng),并對其生物學(xué)特性和增殖動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究,成功篩選并純化出能在KMB17細(xì)胞中穩(wěn)定增殖并具有良好抗原性的適應(yīng)株。此研究將打破登革病毒宿主細(xì)胞局限性,為登革病毒疫苗的研發(fā)開拓新的思路,為研發(fā)我國擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的登革病毒滅活疫苗及減毒活疫苗奠定基礎(chǔ)。材料和方法1東省疾病預(yù)防控制中心Ⅲ型登革病毒中國株D9964為廣東省疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng),KMB17細(xì)胞(第21代)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所分子流行病室保存。2抗血清、igg和型登革病毒人源MEM培養(yǎng)基由該所生物制品四室提供;新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司;Ⅲ型登革病毒人源抗血清購自英國國家生物制品檢定所(NIBSC);FITC標(biāo)記的兔抗人IgG購自Sigma公司;病毒RNA/DNA抽提試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;RealTime-PCR試劑盒購自大連寶生物公司。3方法3.1rt-pcr擴(kuò)增根據(jù)衛(wèi)生部發(fā)行的《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》中所述的“RT-PCR技術(shù)檢測登革病毒RNA及型別鑒定”方法,合成登革病毒通用引物(D1和D2)和Ⅲ型登革病毒型特異性引物(D1和TS4)。以收獲10代的病毒培養(yǎng)物基因組RNA為模板,通過RT-PCR對Ⅲ型登革病毒特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增片段大小分別為511bp和393bp。引物序列D1:5′-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3′,D2:5′-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3′TS3:5′-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3′。反應(yīng)條件:50℃30min合成cDNA;94℃預(yù)變性2min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7min。3.2細(xì)胞增殖檢測以100μlⅢ型登革病毒中國株D9964接種長至單層、生長狀態(tài)良好的C6/36細(xì)胞,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7~10d,待細(xì)胞病變達(dá)++++,收集細(xì)胞液,于4℃,3000r/min離心5min后收獲上清,-70℃保存。采用微量滴定法測定病毒滴度,將vero細(xì)胞按104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待細(xì)胞長成致密單層后,將病毒用含2%血清MEM培養(yǎng)基以10倍系列稀釋,每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,每孔加入100μl,并設(shè)細(xì)胞對照和未稀釋病毒對照。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)7d,記錄細(xì)胞病變程度。按Reed-Muench公式計(jì)算病毒的感染性滴度。3.3細(xì)胞培養(yǎng)和增殖將-70℃保存的登革病毒于37℃水浴5min,用PBS將已鋪滿單層,生長狀態(tài)良好的KMB17細(xì)胞洗滌1次,以4.0MOI的毒種進(jìn)行適應(yīng)性傳代,加入含2%血清的MEM維持液,于37℃、5%CO2培養(yǎng)7d,鏡下觀察細(xì)胞病變(CPE)。培養(yǎng)7d后收毒,反復(fù)凍融2次,再以同樣方法接種下一代,直至細(xì)胞出現(xiàn)病變,CPE達(dá)++++,篩選出的能夠在KMB17細(xì)胞上增殖的毒株檢測滴度并于-70℃保存。將篩選出的登革病毒以4.0MOI接種長至單層、狀態(tài)良好的KMB17細(xì)胞,在5%血清濃度的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),連續(xù)傳10代。采用微量滴定法測定每代病毒液感染性滴度。3.4細(xì)胞培養(yǎng)和病毒的分離培養(yǎng)利用KMB17細(xì)胞對選育出的Ⅲ型登革病毒D9964細(xì)胞適應(yīng)株進(jìn)行噬斑篩選純化。棄去6孔板中已生長成單層的KMB17細(xì)胞的培養(yǎng)液,用Hanks液漂洗2次。用不含血清的維持液將病毒稀釋后以4.0MOI接種細(xì)胞,置37℃孵育4h,每隔15min輕輕水平晃動(dòng)培養(yǎng)板數(shù)次,以保證病毒與細(xì)胞充分接觸。吸附完畢吸出病毒液,加1ml含0.1%中性紅,5%胎牛血清的MEM瓊脂糖培養(yǎng)基,倒置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2d之后每天觀察2次,記錄蝕斑出現(xiàn)和生長情況,直至大小適宜時(shí)吸取斑點(diǎn),以維持液稀釋后接種96孔板,收集病變孔的培養(yǎng)液,以上述方法進(jìn)行3輪蝕斑純化。3.5實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的擴(kuò)增用免疫熒光法檢測病毒抗原性。以KMB17細(xì)胞接種放有玻片的6孔板,長至單層后各2孔細(xì)胞以4.0MOI接種登革病毒原液和KMB17細(xì)胞第10代適應(yīng)株,2孔作對照,用含5%血清MEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72h,取出孔里的玻片進(jìn)行熒光染色。一抗為Ⅲ型登革病毒抗血清,二抗為FITC標(biāo)記的羊抗人IgG。3.6病毒適應(yīng)株在細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)將病毒純化株接種KMB17細(xì)胞,以第3~7d細(xì)胞培養(yǎng)上清液提取RNA為模板,通過Real-timePCR檢測病毒適應(yīng)株在細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)。引物為:FP:5′-GCATATTGACGCTGGGAGAGA-3′,RP:5′-GGCGTTCTGTGCCTGGAAT-3′.反應(yīng)條件:45℃5min合成cDNA;94℃預(yù)變性2min;94℃30s,60℃30s,共40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7min。結(jié)果1rt-pcr擴(kuò)增以獲得的登革病毒基因組RNA為模板,通過RT-PCR對Ⅲ型登革病毒特異性基因進(jìn)行擴(kuò)增,獲得511bp的登革病毒特異性條帶和290bp的Ⅲ型登革病毒型特異性條帶。2病毒登格病毒的擴(kuò)散和滴注量的測定以C6/36細(xì)胞擴(kuò)增收獲200mlⅢ型登革病毒,微量滴定法測定病毒感染性滴度為3.50CCID50/mL。3鄧氏病毒適用于kb-17細(xì)胞的培養(yǎng)登革病毒接種KMB17細(xì)胞傳至第3代時(shí)第7d細(xì)胞出現(xiàn)病變,到第12d達(dá)+++,證明登革病毒已適應(yīng)在KMB-17細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。4病毒感染情況檢測結(jié)果顯示,D9964株在KMB17細(xì)胞上連續(xù)傳代10代,病毒滴度呈持續(xù)升高直至穩(wěn)定的適應(yīng)過程,傳第1和第2代最低,細(xì)胞無明顯病變,傳至第3代時(shí),細(xì)胞開始有明顯病變,病毒的感染滴度達(dá)到2.25CCID50/mL,至第9和第10代滴度最高,達(dá)到5.5CCID50/mL。5養(yǎng)基純化期斑登革病毒在含中性紅的MEM瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng),3輪噬斑純化均在3d后出現(xiàn)微小斑點(diǎn),至5~6d斑點(diǎn)直徑長至約0.8~1mm,此時(shí)大小適宜接種。6免疫熒光登革病毒D9964株在KMB17細(xì)胞上傳代10代后,以Ⅲ型登革病毒抗血清進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果顯示,在接種病毒的細(xì)胞內(nèi)可見明亮的綠色熒光,而對照組細(xì)胞內(nèi)未見綠色熒光,表明選育出的適應(yīng)株在KMB17細(xì)胞中可以增殖并具有良好的抗原性。7不同培養(yǎng)條件對病毒增殖的影響以第3~7d病毒培養(yǎng)物提取RNA為模板檢測D9964病毒純化株在細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài),Real-timePCR結(jié)果顯示樣品擴(kuò)增的Ct值隨病毒培養(yǎng)時(shí)間推移逐漸減小,由于Ct值與初始模板量成反比,因而由擴(kuò)增曲線可看出病毒接種KMB17細(xì)胞后第3d已經(jīng)開始增殖,在第5~6d增殖最為迅速,在第7d病毒增殖達(dá)到最高峰。人源性二倍體細(xì)胞的基因文化和免疫部分近年來,由于全球氣候變暖、人口流動(dòng)頻繁等因素,登革熱在全世界的發(fā)病率提高了近30倍。在過去兩年中全球登革熱感染人群的數(shù)量持續(xù)增長,在東南亞中部和南部地區(qū)、美國以及南太平洋地區(qū),每年約8000萬人感染登革病毒,估計(jì)有24000人死亡,超過100個(gè)國家的30億人受到威脅,已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。迄今為止全球仍沒有獲準(zhǔn)上市的登革病毒疫苗,因此登革疫苗研發(fā)迫在眉睫。在研疫苗中采用的細(xì)胞基質(zhì)大多為動(dòng)物源性細(xì)胞,包括Vero、PDK、PGMK和FrhL等,這些傳代細(xì)胞作為培養(yǎng)基質(zhì)所生產(chǎn)的疫苗產(chǎn)品理論上有致腫瘤的危險(xiǎn),以人源性細(xì)胞制備的登革疫苗候選株還未見報(bào)道。WHO認(rèn)為疫苗的生產(chǎn)應(yīng)首先考慮采用人源性二倍體細(xì)胞或已知特性的傳代細(xì)胞,并應(yīng)嚴(yán)格控制外源因子的污染。KMB-17二倍體細(xì)胞株源于人胚肺組織,對至少71種病毒敏感,且與上述傳代細(xì)胞相比,在理論上不存在致腫瘤的危險(xiǎn)性。此外,初次感染其中一種型別的登革熱病毒后,機(jī)體會(huì)產(chǎn)生針對此型病毒的特異性抗體,如再次感染異型病毒,病毒抗原與抗體形成免疫復(fù)合物,與單核/巨噬細(xì)胞表面的Fc受體或補(bǔ)體結(jié)合,在這些細(xì)胞中大量復(fù)制并且毒力增強(qiáng),出現(xiàn)抗體依賴性感染增強(qiáng)作用(ADE),導(dǎo)致血管通透性增加、血漿外滲、血容量減少,血液濃縮和休克等一系列病理變化,這給登革熱病毒的疫苗研究帶來了很大的挑戰(zhàn)和困難。因此理想的登革疫苗需是四價(jià)的,要求能誘導(dǎo)同時(shí)針對4個(gè)血清型登革病毒的均衡的免疫應(yīng)答,且免疫應(yīng)答水平應(yīng)足夠高。在前期研究中我們已成功篩選出Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型登革病毒的KMB17細(xì)胞適應(yīng)株,本實(shí)驗(yàn)選育出的Ⅲ型登革病毒D9964KMB17細(xì)胞適應(yīng)株將為研究四價(jià)疫苗奠定基礎(chǔ)。下一步將繼續(xù)針對KMB17細(xì)胞擴(kuò)增的四種型別登革病毒配比和佐劑的選擇進(jìn)行探索,制備滅活疫苗候選株,同時(shí)通過一系列體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對其免疫原性以及是否引起抗體依賴的增強(qiáng)作用(ADE)進(jìn)行評(píng)價(jià),確保候選疫苗能夠產(chǎn)生針對四種血清型登革病毒(