基于16srrna基因的溫室黃瓜根圍土壤細(xì)菌多樣性分析

土壤是世界上最大的細(xì)菌遺傳資源。其物理和化學(xué)性質(zhì)、聚集形成和土壤中污染物的分解以及細(xì)菌、群體結(jié)構(gòu)、相互作用、活動和穩(wěn)定性密切相關(guān)。土壤細(xì)菌對土壤中的營養(yǎng)循環(huán),有機質(zhì)的分解和土壤肥力起著很重要的作用,是整個地球生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。研究土壤中的微生物群體有助于我們了解環(huán)境可變性對細(xì)菌多樣性,組成和豐度的影響。近年來,伴隨著人們對反季節(jié)蔬菜需求的不斷擴大,溫室種植面積逐年增加,大量農(nóng)藥化肥的使用,過于倚重于人為的投入,土壤自身微生物的重要性往往被忽視,隨之而來的是蔬菜病蟲害的嚴(yán)重發(fā)生。同時,多年來土地利用類型和結(jié)構(gòu)不斷變化,尤其是糧食生產(chǎn)面積的減少和溫室種植面積的增加,必然帶來土壤生物學(xué)性質(zhì)的變化,尤其是最為敏感的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化,這將影響到土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能發(fā)揮和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。但目前有關(guān)這方面的研究鮮有人涉及,尤其是缺乏對高強度土地利用條件下的土壤微生物多樣性的認(rèn)識。自然環(huán)境中,99%以上的微生物不可用實驗室純培養(yǎng)的方法獲得,成為自然界微生物群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)功能及其相互關(guān)系研究中的最大障礙。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用,微生物多樣性的研究有了新的突破。進入20世紀(jì)90年代末,隨著宏基因組技術(shù)的發(fā)展,基于宏基因組文庫的分析也為微生物多樣性結(jié)構(gòu)和功能基因組的研究,提供了嶄新的思路。因此,本試驗采用16SrRNA基因克隆文庫和宏基因組Fosmid文庫末端隨機測序兩種方法,比較了兩者在反應(yīng)溫室黃瓜根圍土壤細(xì)菌多樣性和豐度之間的差異,分析了溫室黃瓜根圍土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成情況,旨在了解溫室黃瓜根圍土壤細(xì)菌的多樣性以及為揭示土地利用變化與生態(tài)環(huán)境效應(yīng)之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1樣品的采集和預(yù)處理土樣于2008年3月采集自海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗農(nóng)場黃瓜種植地。種植黃瓜年限10a以上。采樣地選擇10個種植黃瓜的地塊。采用五點采樣法,用土壤采樣器采集5個黃瓜根圍土壤樣品(采集直徑10cm,采集深度0—15cm),混合后用密封袋帶回,土樣用10mesh(2mm)篩網(wǎng)過篩,去除小顆粒的石頭和殘存的植物根系,存放于-20℃冰箱中。土壤性質(zhì)見表1。1.2nywelld,oslo,norw參考Bertrand等有所改進。改進部分:沉淀用10mL0.8%NaCl重懸后,補上10mL的PVPP,渦旋混勻,10000r/min,4℃離心10min后棄上清,重復(fù)3—5次,至上清呈淡褐色,沉淀用10mL0.8%NaCl重懸。將10mLNycodenz(Axis-Shield,Oslo,Norway;8gNycodenz溶于10mL滅菌水)加入懸液底部,11000r/min,4℃離心30min。小心收集在Nycodenz-土壤混合顆粒和上層水層分界面上的白色細(xì)胞層,重懸后在10000r/min4℃離心20min去除Nycodenz溶液。緊接著用蛋白酶K-溶菌酶-SDS法提取土壤DNA,用100μLTE溶解,1%瓊脂糖電泳檢測,-20℃保存。1.3pcr擴增及基因克隆以DNA為模板,細(xì)菌16SrRNA基因通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACTTGTTACGACTT-3’)進行PCR擴增。PCR擴增所用反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考照文獻報道的方法。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收1500bp的片段,連接至pGEM-T(Promega,USA)上,E.coliTOP10轉(zhuǎn)化,涂LB板(含Amp+、IPTG和X-Gal),37℃過夜培養(yǎng)。挑白斑,37℃,220rpm,搖動培養(yǎng)12h,每克隆菌液取1μL,用T7和SP6進行菌液PCR,篩選陽性克隆,構(gòu)建基因克隆文庫。菌液PCR引物,T7:5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′,SP6:5′-ACGATTTAGGTGACACTATAG-3′。挑取300個陽性克隆送諾賽基因測序。1.41shrenon-wieenr指數(shù)sh底指數(shù)用ChimeraCheck程序?qū)⑺?6SrRNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫(Ribosomaldatabaseproject,RDP)進行嵌合體檢驗,去除嵌合體序列。以97%為劃定閾值,用DOTUR軟件包劃分操作分類單元(OTU),并構(gòu)建稀缺性曲線。Shannon-Wiener指數(shù)依據(jù)下列公式進行計算:H=∑(pi)(log2p-i)式中,pi代表每個物種樣本數(shù)量占總樣本數(shù)量的比例。均勻度(E)=H/Hmax,Hmax=log2S豐富度S是樣本中物種的數(shù)量,這里等同OTU的數(shù)量Good覆蓋度=[1-(n/N)]×100式中,n代表單克隆OTU的數(shù)量,N代表文庫中克隆總數(shù)量。1.5系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建將每個OTU代表序列在NCBI進行序列比對,并下載一致性最高的序列作為參比序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。采用Mega4.0軟件包,以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。1.6fosmid編碼按照Epicenter公司CopyControlTMHTPFosmidLibraryProductionKit的使用說明,構(gòu)建土壤微生物宏基因組Fosmid文庫。通過對宏基因組文庫進行插入片段大小、克隆穩(wěn)定性和插入片段隨機性檢測,發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的文庫質(zhì)量高,適合多樣性分析和功能基因篩選等方面的研究工作。1.7質(zhì)粒提取與測序隨機挑取296個Fosmid克隆,37℃,250r/min,初搖12h,加入Epicenter公司生產(chǎn)FosmidInducer,37℃,誘導(dǎo)培養(yǎng)24h,使其產(chǎn)生高拷貝后,按照FosmidMAXTMDNAPurificationKit使用說明提取質(zhì)粒DNA,用pCC2FOSTMSequencingPrimers進行單末端測序,正向測序引物為pCC2FOSTM:5′-GTACAACGACACCTAGAC-3′。將所有的congtigs在NCBI原核數(shù)據(jù)庫進行比對。設(shè)定閾值為:HSP長度>150nt,期望值<e-151.8gendk-pcr擴增細(xì)菌文庫中部分克隆尚難確定其分類地位,可能代表新的屬和種。這些序列已在GenBank里邊登錄,并獲得核酸序列登錄號。已獲得的細(xì)菌序列登錄號有:GU395088-GU395090,GU394939-GU394947。2結(jié)果與分析2.11菌株種類和克隆利用DOTUR軟件分析,把序列相似性≥97%的定義為同一個OTU。這樣292個細(xì)菌序列歸屬為35個OTU。其中有22個OTU只有1個克隆,其他的13個OTU類型有兩個或者多個克隆,其中最多的5個OTU類型分別含有56、50、46、42個克隆和22個克隆。同時,利用DOTUR軟件生成的數(shù)據(jù)繪制稀缺性曲線,稀缺性曲線上升幅度逐漸平緩,表明文庫取樣數(shù)量趨近飽和(圖1)。Good覆蓋度為92.5(表2),能夠反應(yīng)細(xì)菌多樣性(表2)。將每個OTU的代表序列在NCBI進行BLAST分析,文庫克隆代表的細(xì)菌大多數(shù)屬于γ-Proteobacteria(41.1%)、α-Proteobacteria(7.5%)、δ-Proteobacteria(5.8%)、β-Proteobacteria(4.5%)和Firmicutes(39.7%),其中γ-Proteobacteria為優(yōu)勢菌群,其次為Firmicutes(圖2),未發(fā)現(xiàn)酸桿菌門(Acidobacteria),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),綠彎菌門(Chloroflexi),浮霉菌門(Planctomycetes)等4個菌門的克隆。在種水平上,各綱包含細(xì)菌種類數(shù)量見圖3。γ-Proteobacteria包含12種細(xì)菌:Enterobactersp.、Klebsiellasp.、Citrobacteramalonaticus、Aeromonassp.、Pseudomonassp.、Shewanellasp.、Aeromonasenteropelogenes、Thermoleovorans、Staphylococcussp.、Citrobacterkoseri、Citrobacteramalonaticus和Unculturedbacterium,其中優(yōu)勢菌為Enterobactersp.(66個克隆)。Firmicutes包含7種細(xì)菌:Bacilluscereus.、Bacillussp.、Planomicrobiumsp.、Bacilluspumilus、Streptococcussanguinis、Geobacillussp.和Unculturedbacteriumclone,其中優(yōu)勢菌為Bacillussp.(94個克隆)。α-Proteobacteria包含6種細(xì)菌:Rhizobiumsp.、Rhodopseudomonaspalustris、Caulobactercrescentus、Methylobacteriumradiotolerans、Agrobacterium和Unculturedbacteriumclone,其中優(yōu)勢菌為Agrobacterium(9個克隆)。β-Proteobacteria包含2種細(xì)菌:Burkholderiasp.和Acidovoraxsp,其中優(yōu)勢菌為Burkholderiasp.(5個克隆)。δ-Proteobacteria包含3種細(xì)菌:Desulfovibrio、Geobactersp.和Planococcusmaritimus,其中優(yōu)勢菌為Planococcusmaritimus(10個克隆)。Bacteroidetes僅包含1種細(xì)菌:Flavobacteriumsp.(2個克隆),Actinomycetales中2個克隆均屬于Streptomycessp.。另外,系統(tǒng)進化發(fā)育樹(圖3)上部分參考序列來源于本實驗室已經(jīng)登錄的北京露地菜田土壤細(xì)菌16SrRNA基因序列,從圖中可以看出,屬于同一個亞門的兩個不同的環(huán)境樣品細(xì)菌物種位于十分靠近的同一分支上,說明進化發(fā)育關(guān)系較近。但是,與露地菜田土壤細(xì)菌克隆文庫相比較,該文庫中γ-Proteobacteria和厚壁菌(Firmicutes)占絕對優(yōu)勢,且都出現(xiàn)了兩個較大的分支,說明同為一個菌門細(xì)菌,其親緣關(guān)系并不一定十分靠近,可能是根據(jù)其表觀特征命名,而忽略了遺傳特性。同時,未發(fā)現(xiàn)類似于露地菜田土壤克隆文庫的芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)克隆。2.2nomicetales和firmicup序列組成及含量將所有拼接的congtigs在NCBI原核數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析,296條序列中有207條序列符合設(shè)定的閾值,依照返回比對結(jié)果的最高相似種類作為序列的分類歸屬,并劃分分類地位。所有序列中γ-Proteobacteria占26.1%,α-Proteobacteria占15.9%,δ-Proteobacteria占4.3%,β-Proteobacteria占8.2%,Actinomycetales占8.7%和Firmicutes占19.8%(圖4),少部分序列屬于Gemmatimonadetes、Chloroflexi、CFBgroupbacteria、planctomycetes、verrucomicrobia和cyanobacteria,此外,還有少部分真菌(ascomycetes)、古菌(euryarchaeotes和crenarchaeotes)、線蟲(nematodes)、病毒(viruses)和毛滴蟲(trichomonads)序列。在屬水平上,末端測序包含的細(xì)菌屬于40個屬(表3),Actinomycetales包含10個屬,Streptomyces為優(yōu)勢菌屬(5條序列)。β-Proteobacteria包含7個屬,Burkholderia為優(yōu)勢菌屬(7條序列)。γ-Proteobacteria包含6個屬,Pseudomonas為優(yōu)勢菌屬(25條序列)。δ-Proteobacteria包含4個屬,Desulfovibrio為優(yōu)勢菌屬(4條序列)。α-Proteobacteria包含10個屬,Nitrobacter為優(yōu)勢菌屬(12條序列)。Firmicutes包含3個屬,Bacillus為優(yōu)勢菌屬(39條序列),僅有兩條序列分別屬于Geobacillussp.和Streptococcus。2.3末端測序結(jié)果的優(yōu)勢菌屬分析在綱分類水平上,16S文庫和宏基因組末端測序結(jié)果中得到的細(xì)菌均包含γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、β-Proteobacteria、Actinomycetales和Firmicutes,但各綱比例有差別(圖2和圖4)。16S文庫中,2個克隆屬Actinomycetales,僅占克隆文庫的0.7%,而在末端測序結(jié)果中占8.7%,同為Proteobacteria,16S文庫中γ-Proteobacteria占絕對優(yōu)勢,而其他Proteobacteria所占的比例較少,在末端測序結(jié)果中各Proteobacteria亞門所占的比例差異較小,在16S文庫中,δ-Proteobacteria所占的比例大于β-Proteobacteria(5.8%>4.5%),而在末端測序結(jié)果中,δ-Proteobacteria所占的比例遠(yuǎn)小于β-Proteobacteria(4.3%<8.2%)。此外,在16S文庫中,未發(fā)現(xiàn)酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、CFB細(xì)菌種群(CFBgroupbacteria)、疣微菌綱(verrucomicrobia)、綠硫細(xì)菌(greensulfurbacteria)和藍(lán)藻細(xì)菌(cyanobacteria)等少量細(xì)菌種群,而在末端測序結(jié)果中均有發(fā)現(xiàn),且有4個末端序列屬于芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),2個屬于綠彎菌門(Chloroflexi)。在綱的水平上,末端測序的結(jié)果反映細(xì)菌多樣性遠(yuǎn)大于16S文庫。在優(yōu)勢種群屬水平上,末端測序的結(jié)果包含的屬多于16S文庫(40>35),并且,每個綱中屬的數(shù)目有所差別(表4)。在γ-Proteobacteria和Firmicutes中,末端測序結(jié)果包含的屬數(shù)目少于16S文庫。在α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、δ-Proteobacteria和Actinomycetales中,末端測序的結(jié)果包含的屬數(shù)目多于16S文庫。在Actinomycetales、β-Proteobacteria和Firmicutes中,兩種方法得到的優(yōu)勢菌屬相同,分別為Streptomyces、Burkholderia和Bacillussp.,而在γ-Proteobacteria中,16S文庫優(yōu)勢菌屬為Enterobactersp.,末端測序的結(jié)果優(yōu)勢菌屬為Pseudomonas;在α-Proteobacteria中,16S文庫優(yōu)勢菌屬為Agrobacterium,末端測序的結(jié)果優(yōu)勢菌屬為Nitrobacter;在δ-Proteobacteria中,16S文庫優(yōu)勢菌屬為Planococcusmaritimus,末端測序的結(jié)果優(yōu)勢菌屬為Desulfovibrio。16S文庫中有個別擬桿菌門(Bacteroidetes)細(xì)菌Flavobacteriumsp.,而末端測序的結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)該類細(xì)菌。3其他生物學(xué)分析方法16S文庫和末端測序的結(jié)果均表明溫室黃瓜根圍土壤細(xì)菌多樣性較高。16SrRNA文庫包含35個OTU,35個屬,宏基因組末端序列代表的細(xì)菌屬有40個,基本上能夠涵蓋不同類型的該環(huán)境樣品細(xì)菌。在綱分類水平上,兩種方法獲得的細(xì)菌差異不大,均屬于γ-Proteobacteria、Firmicutes、α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和δ-Proteobacteria,γ-Proteobacteria為優(yōu)勢菌群。這和近幾年來其他研究人員利用16SrRNA基因克隆文庫的方法對土壤樣品進行分析所獲得的結(jié)果基本一致,但在種群豐度上有一定的差異。本研究通過兩種不同的方法,同時對溫室黃瓜根圍土壤微生物多樣性進行了分析,均發(fā)現(xiàn)Firmicutes是僅次于γ-Proteobacteria的優(yōu)勢均群。這可能與溫室長年高溫高濕,高有機質(zhì)含量,酸堿度極端(偏酸或偏堿),種植單一作物,作物與環(huán)境微生物之間相互作用而形成的微防御體系有關(guān)。長期以來,厚壁菌門芽孢桿菌被作為生防模式菌株得到人們的廣泛研究。但是,可純培養(yǎng)的芽孢桿菌極其有限。本研究構(gòu)建的宏基因組文庫,包含的微生物基因資源豐富,特別是含有大量的芽孢桿菌,既有利于從生態(tài)學(xué)的角度上分析溫室黃瓜根圍土壤微生物多樣性,又有利于篩選和改造芽胞生防菌株。研究根圍微生物多樣性也還有其他分子生物學(xué)方法。如分子標(biāo)記技術(shù)和分子檢測技術(shù),分子標(biāo)記技術(shù)包括限制性片斷長度多態(tài)(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、隨機擴增DNA多態(tài)性(RandomamplifiedpolymorphismDNA,RAPD)、擴增核糖體DNA限制性分析(AmplifiedrDNArestrictionanalysis,ARDRA)等;分子檢測技術(shù)包括變性梯度(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)、溫度梯度凝膠電泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)等。但是,所有這些研究方法都是基于DNA片段大小的瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的,對酶切條帶的觀察未免會產(chǎn)生一定誤差。因此,微生物的多樣性水平必然會失真。本研究采用的兩種方法都是基于序列分析的基礎(chǔ)上的,根據(jù)序列相似性水平來進行研究,能夠更好地了解細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和不同物種間的豐度。16S方法存在偏嗜性及擴增異常,出現(xiàn)嵌合基因、異源雙鏈和突變,會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實性。另外,該方法會造成含16SrRNA基因拷貝數(shù)多的細(xì)菌數(shù)量偏高,且使得那些由于難以裂解細(xì)胞壁而釋放DNA少的細(xì)菌數(shù)量偏低,在反映物種豐度上必然會存在一定的誤差,尤其是稀有物種的存在與否。但是,16S文庫是根據(jù)