細(xì)胞周期素依賴激酶抑制劑olomoucine對(duì)脊髓損傷后軸突再生微環(huán)境的影響

骨髓損傷（rc）后，膠體細(xì)胞過度激活，形成膠體瘢痕。致密的膠質(zhì)瘢痕以及其分泌的以硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPG)為主的大量抑制因子,嚴(yán)重阻礙了軸突再生。改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后的微環(huán)境可能有利于軸突的再生從而促進(jìn)脊髓損傷后結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。我們的前期研究已經(jīng)表明,給予細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(CDK)抑制劑olomoucine調(diào)控細(xì)胞周期,可有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂,從而抑制其過度活化、增殖。本研究采用免疫熒光技術(shù)和免疫印跡等方法,觀察olomoucine對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠SCI后細(xì)胞周期素(cyclin)A、cyclinB1、cyclinE和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)、膠質(zhì)瘢痕形成、CSPG的分泌以及對(duì)軸突再生的標(biāo)志物之一生長相關(guān)蛋白43(GAP-43)表達(dá)的影響,從而探討其對(duì)損傷后軸突再生微環(huán)境的影響及意義。小鼠單克隆抗體pahs的制備1.動(dòng)物分組及模型制備:健康SD大鼠45只,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,雌雄不限,體重200～250g。隨機(jī)分為假手術(shù)組、損傷對(duì)照組和olomoucine干預(yù)組,每組各15只。脊髓半切損傷模型制備參照Tuszynski等的方法,6%水合氯醛(0.5ml/100g)腹腔注射麻醉后,以T10棘突為中心,暴露5mm長的脊髓節(jié)段,假手術(shù)組到此即可止血縫合。損傷對(duì)照組和olomoucine干預(yù)組則用眼科手術(shù)剪縱向剪開硬脊膜,以尖刀片緊貼脊髓后正中動(dòng)脈左側(cè)(避免損傷后正中血管),垂直刺入脊髓腹側(cè)達(dá)骨質(zhì)后劃向左側(cè),距吻側(cè)切口3mm處重復(fù)1次切割,在兩者間用顯微手術(shù)剪將左側(cè)半完全離斷,并盡量取出脊髓。無創(chuàng)縫線縫合硬脊膜,將明膠海綿貼于表面徹底止血,逐層縫合肌肉和皮膚。術(shù)后給予抗生素,必要時(shí)補(bǔ)液。每日膀胱按摩2次至其排尿反射恢復(fù)為止。損傷干預(yù)組在脊髓損傷后30min、24h時(shí)分別腹腔注射olomoucine[美國Sigma公司,4mg/kg,用二甲基亞砜(DMSO)溶解后雙蒸水稀釋至DMSO終濃度為2%];損傷對(duì)照組和假手術(shù)組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量的DMSO稀釋液。2.標(biāo)本取材和準(zhǔn)備:各實(shí)驗(yàn)組大鼠(每組5只)于術(shù)后4周時(shí)在麻醉狀態(tài)下,4%多聚甲醛溶液灌注固定,取以傷段為中心長約15mm的損傷脊髓節(jié)段置于4%多聚甲醛溶液中固定6h,30%蔗糖溶液中4℃沉底。冰凍切片包埋劑包裹,異戊烷中驟凍后置于-70℃冰箱保存。取出待切組織于-20℃恒冷箱切片機(jī)中連續(xù)切片,片厚10μm。3.Western印跡:各組大鼠(每組5只)于術(shù)后3d時(shí)快速剝?nèi)p傷節(jié)段脊髓組織,加入裂解液冰上孵育并徹底勻漿、離心后留取上清,考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白;全濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上;5%脫脂奶粉封閉2h后分別加入相應(yīng)的一抗(包括兔抗cyclinA、cyclinB1和cyclinE抗體,美國Neomarkers公司,稀釋度均為1∶100);小鼠單克隆抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)抗體,北京中山公司,稀釋度1∶200;內(nèi)參為兔抗肌動(dòng)蛋白,武漢博士德公司,稀釋度1∶300)4℃孵育過夜。用TBST溶液(含0.05%吐溫-20的TBS)洗滌10min×3次;加入相對(duì)應(yīng)的二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG,稀釋度均為1∶300,北京中山公司),37℃孵育90min;TBST洗膜10min×3次,DAB系統(tǒng)顯色,雙蒸水終止反應(yīng)。凝膠成像分析系統(tǒng)攝像并進(jìn)行分析,結(jié)果以目的條帶灰度值與同一樣本肌動(dòng)蛋白灰度值的比率來表示。4.免疫熒光染色:冰凍切片經(jīng)固定后,用10%牛血清白蛋白封閉2h,滴加膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)兔抗大鼠多克隆抗體(北京中山公司,1∶100)和CSPG小鼠單克隆抗體(美國Sigma公司,1∶500)以及兔抗大鼠GAP-43抗體(美國Chemicon公司,1∶500)后置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS洗后,分別滴加相對(duì)應(yīng)的二抗(FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG,北京中山公司,1∶100;CY3標(biāo)記的驢抗鼠IgG,美國JacksonImmunoReseach公司,1∶100),室溫避光孵育40min后流水沖洗,50%甘油封片,熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。采用OLYMPUSMicroImage4.0圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。5.后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估:分別于術(shù)后1d、1、2、4、6、8周采用改良Gale聯(lián)合評(píng)分法(CBS),對(duì)動(dòng)物癱瘓后肢進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估,包括開放空間中運(yùn)動(dòng)能力、腳趾伸展能力、觸地反應(yīng)、回縮反射、矯正反射、斜板試驗(yàn)、游泳試驗(yàn)等7項(xiàng)評(píng)定。正常為0分,全癱為100分。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料以x±s表示,運(yùn)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,組間比較采用單因素方差分析。星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖1.Western印跡分析:假手術(shù)組3d時(shí)cyclinA、cyclinB1、cyclinE和PCNA表達(dá)微弱,脊髓損傷后表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01),給予olomoucine干預(yù)可顯著下調(diào)cyclinA、cyclinB1、cyclinE和PCNA的表達(dá)(P<0.05)(圖1)。2.免疫熒光染色:假手術(shù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)纖細(xì),數(shù)目較少,GFAP、CSPG以及GAP-43的表達(dá)較弱;SCI后損傷區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化增生,表現(xiàn)為胞體肥大,突起增多增粗,GFAP表達(dá)增強(qiáng),細(xì)胞密度增加,并可見粗大的膠質(zhì)瘢痕形成,在損傷區(qū)CSPG免疫反應(yīng)性也明顯增強(qiáng)(P<0.05),并與GFAP的表達(dá)部分重疊,損傷區(qū)域GAP-43表達(dá)也有所增強(qiáng);olomoucine干預(yù)后GFAP和CSPG表達(dá)明顯減弱,膠質(zhì)細(xì)胞增生顯著受抑,未見明顯的膠質(zhì)瘢痕形成,GAP-43的表達(dá)較損傷對(duì)照組也明顯增加(P<0.05)(圖2,3)。3.運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估:損傷對(duì)照組與olomoucine干預(yù)組大鼠術(shù)后損傷同側(cè)后肢明顯癱瘓,但前2周兩組大鼠后肢功能評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,2周后各時(shí)段差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),olomoucine干預(yù)組運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估明顯優(yōu)于損傷組(圖4)。cspg的調(diào)節(jié)作用成年哺乳動(dòng)物CNS損傷后軸突往往不能有效再生,而造成不可逆性的神經(jīng)功能缺損。影響CNS有效修復(fù)的原因相當(dāng)復(fù)雜,主要?dú)w結(jié)于以下兩方面的作用:一是CNS神經(jīng)元本身缺乏有效的再生能力,二是它們的再生被抑制性的CNS微環(huán)境所抑制。后者可能起著更為重要的作用。其中以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主要成分的膠質(zhì)瘢痕,以及其產(chǎn)生的包括CSPG在內(nèi)的一些抑制性因子,是影響SCI后軸突再生的關(guān)鍵因素之一。如何有效地控制SCI后膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖及其產(chǎn)生的抑制因子、改善損傷后CNS微環(huán)境從而促進(jìn)軸突再生是目前研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。CSPG是一組共價(jià)結(jié)合硫酸葡聚糖鏈的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì),在受損的CNS中主要是由活化增生的星形細(xì)胞產(chǎn)生,也可由少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞和腦脊膜細(xì)胞產(chǎn)生。曾有研究發(fā)現(xiàn),將周圍神經(jīng)組織植入大鼠脊髓的損傷區(qū)域后能夠再生,但再生的軸突到達(dá)CSPG豐富的損傷區(qū)后就停滯不前,表明CSPG對(duì)SCI損傷后的軸突再生有明顯的抑制作用。Bradbury等用軟骨素酶降解損傷脊髓內(nèi)的CSPG,能明顯促進(jìn)感覺與運(yùn)動(dòng)軸突的再生,并恢復(fù)一定的功能。我們的前期工作提示,膠質(zhì)細(xì)胞具有活躍的細(xì)胞周期,在缺血或損傷刺激下,部分膠質(zhì)細(xì)胞快速進(jìn)入細(xì)胞周期,進(jìn)行有絲分裂,最終使其數(shù)目增加。我們?cè)谛切文z質(zhì)細(xì)胞體外劃痕損傷模型中和腦梗死模型中,曾給予CDK抑制劑olomoucine進(jìn)行了干預(yù),發(fā)現(xiàn)它可以顯著抑制損傷后膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化和增殖。我們希望通過對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控,來抑制SCI后膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和膠質(zhì)瘢痕的形成、減少相關(guān)抑制性因子的產(chǎn)生,從而有效改善脊髓損傷后軸突再生微環(huán)境,促進(jìn)肢體功能的恢復(fù)。olomoucine是一種嘌呤衍生物,主要是通過競爭性抑制CDK的ATP結(jié)合位點(diǎn)抑制CDK1、CDK2及CDK5等酶的活性,從而抑制cyclinB/CDK1、cyclinE/CDK2、cyclinA/CDK2等復(fù)合物和ERK1/MAP激酶的活性。這些復(fù)合物、激酶能與其底物發(fā)生作用,推動(dòng)細(xì)胞周期繼續(xù)進(jìn)展、啟動(dòng)DNA復(fù)制和有絲分裂。抑制CDK則使細(xì)胞周期停滯于G1/S和G2/M轉(zhuǎn)折點(diǎn),細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞分裂受到阻滯,從而達(dá)到抑制細(xì)胞分裂增殖的目的。PCNA是反映細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo),cyclinA、cyclinB1、cyclinE則是細(xì)胞周期中的G1/S和G2/M轉(zhuǎn)折點(diǎn)的重要的細(xì)胞周期素,促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分裂。本研究中的Western印跡結(jié)果顯示,olomoucine干預(yù)可以明顯下調(diào)脊髓損傷組cyclinA、cyclinB1、cyclinE和PCNA的高表達(dá),從而有效抑制細(xì)胞的增殖。我們的免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),脊髓損傷后CSPG在膠質(zhì)瘢痕中的表達(dá)明顯增多,大部分與GFAP的表達(dá)重疊,直接提示CSPG可能大部分由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成分泌,并為神經(jīng)元軸突再生的重要抑制因子。給予olomoucine干預(yù)后可以明顯減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和增殖,抑制膠質(zhì)瘢痕形成,有效下調(diào)GFAP和CSPG的表達(dá)。GAP-43是神經(jīng)元軸突生長發(fā)育和可塑性的分子標(biāo)記物,SCI后GAP-43的表達(dá)上調(diào),表明其可能參與了損傷后的生長修復(fù)過程。正常的成熟CNS中GAP-43較微弱,而給