杜仲對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

腎間質(zhì)纖維是導(dǎo)致慢性腎衰竭的共同途徑和最終途徑，許多因素參與了腎間質(zhì)纖維的進(jìn)程。如何延緩腎纖維化的進(jìn)程,保護(hù)腎功能,已經(jīng)成為治療腎纖維化的關(guān)鍵問題。本實驗旨在觀察中藥杜仲對單側(cè)輸尿管梗阻(unilateralureteralobstruction,UUO)大鼠腎臟病變的保護(hù)作用并探討其作用機制,主要觀察UUO大鼠腎臟α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和纖維連接蛋白(FN)表達(dá),血液生化指標(biāo)及腎臟病理學(xué)的變化,探討α-SMA和FN在纖維化進(jìn)程中的作用;同時給予中藥杜仲干預(yù)治療,探討其是否通過影響上述指標(biāo)表達(dá)而發(fā)揮治療作用。材料和方法1實驗材料1.1體重20020g清潔級SD雄性大鼠32只,由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物中心提供,體重(200±20)g。飼養(yǎng)條件:溫度(23±2)℃,相對濕度為(55±2)%,定時日光燈照射12h/d,房間保持通風(fēng)、恒溫、安靜,定期更換墊料,清洗籠具。1.2血藥濃度和藥物:兔抗鼠多克隆抗體,ba1732α-SMA抗體(兔單克隆抗體,SR0610),購自杭州華安生物技術(shù)有限公司;FN抗體(兔抗鼠多克隆抗體,BA1772),SP免疫組織化學(xué)試劑盒,均購自武漢博士德生物工程有限公司。顯色底物為DAB,北京中山生物技術(shù)有限公司;杜仲(免煎中藥)由三九醫(yī)藥股份有限公司提供(批號:0809011);替米沙坦由浙江金立源藥業(yè)有限公司提供(批號:20090102)。2實驗方法2.1大鼠單次給藥和模型組的建立建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化大鼠模型,方法參照文獻(xiàn)報道:10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠,取右側(cè)臥位,背部左肋下備皮,常規(guī)消毒,選左側(cè)背部肋下0.5cm為切口,打開腹腔,游離左腎及左側(cè)輸尿管,將左側(cè)輸尿管用組織鉗托起,取中上段,用止血鉗夾住,在兩端用絲線結(jié)扎后剪斷左側(cè)輸尿管,然后逐層縫合;假手術(shù)組打開腹腔后即縫合。隨機分為4組:模型組、假手術(shù)組、替米沙坦組和杜仲組,每組8只,組間大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義。手術(shù)前2d開始給藥,假手術(shù)組、模型組均給予等量生理鹽水灌胃;厄貝沙坦組給予厄貝沙坦10mg·kg-1·d-1、杜仲組給予杜仲6g·kg-1·d-1(用藥量相當(dāng)于成人每天每公斤體重的20倍)灌胃。2.2血生化指標(biāo)檢測術(shù)后第2周脫髓處死所有大鼠,10%水合氯醛以0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠,從頸總動脈采血,離心分離血清,用于測定血生化指標(biāo);剖取左側(cè)腎臟,剝離包膜,用10%中性甲醛溶液固定,石蠟包埋切片,以3μm的石蠟切片,常規(guī)行HE和Masson染色,其他切片用于免疫組化分析。2.3腎組織皮質(zhì)區(qū)病理組織學(xué)檢測取左側(cè)腎組織,用10%中性甲醛溶液固定,石蠟包埋切片,以3μm的石蠟切片行HE、Masson染色。雙盲法觀察腎皮質(zhì)間質(zhì)變化情況。腎小管間質(zhì)損害程度按Mezzano方法進(jìn)行半定量分級。0級:正常;Ⅰ級:腎小管上皮細(xì)胞輕度萎縮、變性,壞死輕,呈灶性分布,少量散在炎性細(xì)胞浸潤,纖維組織增生成小灶狀、少量分布,病變范圍<25%;Ⅱ級:腎小管上皮細(xì)胞中度萎縮、變性,壞死輕,炎性細(xì)胞浸潤,纖維組織中度增生,病變范圍25%～50%;Ⅲ級:腎小管上皮細(xì)胞萎縮、變性和壞死重,呈片分布,大量彌漫或聚集成灶的炎性細(xì)胞浸潤,纖維組織增生呈束狀、多灶或網(wǎng)狀成片,病變范圍>50%。觀察連續(xù)不重疊的10個高倍皮質(zhì)視野,綜合進(jìn)行評定。光鏡下觀察腎臟組織皮質(zhì)區(qū)腎小管及間質(zhì)的結(jié)構(gòu)及變化。切片在HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析軟件上,每張切片隨機選取5個高倍視野,測定一定面積內(nèi)陽性信號面積和陽性信號平均灰度值,陽性信號指數(shù)(PI)=陽性信號面積×陽性信號平均灰度/測定面積。2.4陰性對照的制備免疫組織化學(xué)染色使用SP法,實驗中每次染色時均同時以PBS液替代一抗作陰性對照。鏡下觀察結(jié)果,腎實質(zhì)及間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)棕褐色顆粒為陽性。3統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用(xˉ±s)(xˉ±s)表示,用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料采用卡方檢驗,多組計量資料間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1兩組假手術(shù)組與假手術(shù)組比較造模后UUO組大鼠血尿素氮及肌酐均明顯升高,與假手術(shù)組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);兩藥物組有所下降,但與假手術(shù)組相比,上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。2腎病理觀察2.1腎肉眼觀察假手術(shù)組腎臟大小形態(tài)正常,顏色暗紅;UUO模型組結(jié)扎側(cè)腎臟腫大,顏色變淺,有囊性感,內(nèi)含混濁尿液,腎實質(zhì)變薄。2.2各組腎間質(zhì)、間質(zhì)組織形態(tài)的變化光鏡下假手術(shù)組腎小球及腎小管間質(zhì)正常;UUO模型組腎小管上皮細(xì)胞彌漫空泡變性,多數(shù)腎小管管腔擴張,間質(zhì)多灶狀單核細(xì)胞浸潤和纖維化;而替米沙坦組和杜仲組相仿,間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞則呈小灶性浸潤,少許上皮細(xì)胞腫脹,少部分腎小管輕度擴張,腎間質(zhì)未見明顯纖維化。UUO模型組可見腎間質(zhì)大量膠原纖維增生,間質(zhì)膠原纖維呈藍(lán)色染色,間質(zhì)纖維化呈灶狀分布,腎小球病變不明顯;兩藥物干預(yù)組上述改變均有所減輕。見表2,圖1、圖2。3腎組織pi值和替米沙坦檢測假手術(shù)組大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿、腎小球臟層上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)血管壁有少量表達(dá),染色為顆粒狀,著色稀疏;UUO模型組腎小管上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)明顯增多,呈不均勻顆粒狀,且與局部炎細(xì)胞浸潤、間質(zhì)增寬以及腎小管損傷程度一致,腎小球表達(dá)不明顯;兩藥物組表達(dá)均較UUO模型組明顯降低,但仍較假手術(shù)組明顯。UUO模型組α-SMA和FN免疫組化PI值較假手術(shù)組明顯上調(diào)(P<0.05),提示α-SMA和FN在UUO大鼠腎小管上皮中表達(dá)明顯增強;兩藥物組PI值均較UUO組降低(P<0.05),但仍高于假手術(shù)組(P<0.05);兩藥物組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示杜仲和替米沙坦均可抑制α-SMA和FN在UUO模型組大鼠腎組織中蛋白表達(dá)的上調(diào);然而杜仲的作用不如替米沙坦明顯,但二者差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3,圖3、圖4。藥養(yǎng)對腎間質(zhì)纖維化的作用腎間質(zhì)纖維化(renalinterstitialfibrosis,RIF)是各種腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的一個共同途徑,小管間質(zhì)的病變及其嚴(yán)重程度決定著腎臟病的預(yù)后,關(guān)于RIF的發(fā)病機制目前尚未闡明。已有的研究表明,其與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)成分在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增生有密切關(guān)系。腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞是纖維形成的主要效應(yīng)細(xì)胞,其大量增殖、活化是產(chǎn)生過量ECM的先導(dǎo),在增加ECM成分合成中發(fā)揮重要作用。當(dāng)成纖維細(xì)胞受到刺激后,轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MFB),后者合成ECM的能力顯著增強。在此過程中,MFB首先分泌纖維連接蛋白(fibronectin,FN),為其他ECM的成分沉積和膠原纖維的形成提供支架,之后才分泌膠原成分(主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原)、層黏連蛋白和蛋白聚糖等。α-SMA作為肌成纖維細(xì)胞的主要表達(dá)產(chǎn)物,被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。有研究顯示,α-SMA表達(dá)的多少與腎間質(zhì)纖維化的程度呈正相關(guān)。FN是細(xì)胞外基質(zhì)主要成分之一,腎纖維化雖與多種因素相關(guān),但主要因纖維連接蛋白、層黏連蛋白、膠原蛋白Ⅳ等過度產(chǎn)生或沉積所致。纖維連接蛋白是一種始動因素,可能誘導(dǎo)Ⅳ膠原的形成、促進(jìn)腎小球硬化和腎纖維化同時FN還被認(rèn)為是反映細(xì)胞外基質(zhì)早期變化的敏感指標(biāo)之一。杜仲入藥已有兩千多年的歷史,《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為“藥之上品”,言其:主腰脊痛,補中,益精氣,堅筋骨,強志,除陰下癢濕,小便余瀝。久服輕身耐老。近年來,國內(nèi)外許多學(xué)者對杜仲的化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行了大量研究,發(fā)現(xiàn)杜仲具有調(diào)節(jié)血壓、降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗菌、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞生長等藥理作用,以及延緩衰老、美白養(yǎng)顏、滋陰補腎、強壯筋骨等功效。本研究應(yīng)用杜仲對UUO大鼠模型進(jìn)行干預(yù),并以替米沙坦作為陽性對照,觀察了α-SMA和FN蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果顯示,模型組腎小管間質(zhì)區(qū)域可見α-SMA和FN表達(dá)最高,而杜仲組和替米沙坦組則能明顯降低α-SMA和FN的表達(dá),且與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但兩藥物組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);說明杜仲與替米沙坦均能有效抑制腎間質(zhì)中α-SMA和FN的過度表達(dá),從而改善腎間質(zhì)纖維化。杜仲與ARB類藥物相比,同