男科實(shí)驗(yàn)室檢查及質(zhì)控臨床技術(shù)操作規(guī)范男性不育與精液（semen）質(zhì)量密切相關(guān)，精液由精漿（seminalplasma）和精子（sperm）組成，在射精時(shí)由睪丸和附睪的分泌液及懸浮其中的精子與前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。精液分析是評(píng)估男性生育能力的重要方法，也是男科疾病診斷、療效觀察的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但精液分析的各參數(shù)也不是特異的，它并不能夠確定到達(dá)受精位置的少數(shù)精子的受精能力，因此要正確地評(píng)價(jià)男性生育能力還需要結(jié)合臨床進(jìn)行綜合評(píng)估（表16-1)。表16-1精液分析的正常參考值WH0第4版參考值WH0第5版參考值精液體積≥2.0ml≥1.5mlpH7.2-8.0≥7.2液化時(shí)間60min黏稠度精液液化后的拉絲≤2cm精子濃度≥20x106/ml≥15x106/ml精子活力a級(jí)精子25%,或a+b級(jí)精子50%PR≥32精子活動(dòng)率≥60%PN+NP≥40%正常形態(tài)精子百分率≥15%≥4%精子存活率≥75%≥58%精漿中性葡糖苷酶35.1-87.7U/ml≥20mU/一次射精精漿果糖0.87-3.95g/L≥13/一次射精精漿鋅0.8-2.5mmol/L≥2.4umol/一次射精低滲膨脹率≥70%≥58%頂體完整率≥75%白細(xì)胞計(jì)數(shù)1x106/ml免疫珠試驗(yàn)10%50%MAR試驗(yàn)10%50%第一節(jié)精液標(biāo)本采集一、精液采集前準(zhǔn)備精液采集與分析必須嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行，才能提供受檢者的準(zhǔn)確信息。精液采集規(guī)范化是做好精液分析的前提條件，在精液采集前應(yīng)告知受檢者有關(guān)精液采集和運(yùn)送的方法及注意事項(xiàng)。精液標(biāo)本采集須禁欲2-7d。如需多次采集標(biāo)本，每次禁欲天數(shù)盡可能一致。精液標(biāo)本采集必須完整，如果標(biāo)本不完整，受檢者要報(bào)告精液標(biāo)本任何部分的丟失情況，尤其是含精子濃度最高的初始部分精液，以免影響精子濃度的測(cè)定，并在報(bào)告中注明。由于精液分析受多種因素的影響，不能憑一次的精液結(jié)果作出判斷，應(yīng)間隔1-2周進(jìn)行2次或3次以上的分析。如果兩次的結(jié)果有明顯的差異，應(yīng)再進(jìn)行分析。二、精液標(biāo)本的采集方法1.采集精液推薦使用手淫采集，如有困難可用儀器輔助。用對(duì)精子無(wú)毒性作用的廣口玻璃杯或塑料容器收集精液，溫度保持在25-37℃，以避免降低精子活力。精液采集一定要完全，不完整的精液不宜進(jìn)行分析。2.禁用性交中斷法采集精液，這種方法容易造成丟失精液的前一部分。如手淫取精有困難，可用特制的避孕套進(jìn)行精液采集，不能用市售乳膠或塑料制品的避孕套，因?yàn)楸茉刑變?nèi)含有殺精劑。3.為避免精液暴露于溫度波動(dòng)的環(huán)境和控制從采集到檢測(cè)的時(shí)間，安排靠近實(shí)驗(yàn)室的私密房間采集標(biāo)本。推薦用手淫的方法采集精液，取精前洗凈雙手和陰莖。充分勃起陰莖并盡量興奮，將精液全部射人指定容器中，如確有困難可選擇以下方法進(jìn)行:家中樣本采集;避孕套采集，只能用經(jīng)特殊設(shè)計(jì)對(duì)精子沒(méi)有毒性的避孕套來(lái)采樣。以上受檢者應(yīng)記錄采集的時(shí)間，并在1h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。在送至實(shí)驗(yàn)室途中樣本應(yīng)保持在20-37℃的環(huán)境中。4.進(jìn)行微生物檢測(cè)精液樣本的采集:須避免來(lái)自精液以外的污染，受檢者需按下列步驟進(jìn)行:排尿;用肥皂清洗手和陰莖;沖去殘留肥皂;用無(wú)菌毛巾擦手和陰莖;精液射人無(wú)菌容器中。精液樣本的收集至實(shí)驗(yàn)室微生物操作開(kāi)始的時(shí)間不超過(guò)3h。淋球菌對(duì)溫度和氧氣敏感，精液標(biāo)本應(yīng)在20min之內(nèi)檢查。5.精液標(biāo)本采集后記錄采集時(shí)間，并注明患者姓名、采集日期和時(shí)間、禁欲時(shí)間、標(biāo)本采集是否完整、標(biāo)本采集過(guò)程中的困難以及標(biāo)本從采集到分析的時(shí)間間隔等，標(biāo)本應(yīng)盡量在1h內(nèi)檢測(cè)，一定不能超過(guò)2小時(shí)檢測(cè)，液化時(shí)間觀察應(yīng)在精液標(biāo)本采集后就開(kāi)始。精液標(biāo)本采集后在實(shí)驗(yàn)室存放或在轉(zhuǎn)送過(guò)程中，其溫度應(yīng)保持在25-37℃，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響精子活力。6.生物安全:精液是潛在的傳染源，精液標(biāo)本應(yīng)視為生物危險(xiǎn)品，其可能含有有害的感染物質(zhì)，如HIV、HBV、HsV等，操作者應(yīng)注意自身安全防護(hù)。第二節(jié)精液常規(guī)分析精液常規(guī)檢查包括精液體積、液化時(shí)間、酸堿度、黏稠度、精子濃度、活力和活率分析等。一、精液外觀剛射出的精液通常為灰白或淡黃色，自行液化后為半透明乳白色或淡黃色的均質(zhì)、半流體液體。長(zhǎng)時(shí)間未排精的精液為淡黃色或暗黃色，黃疸患者和服用維生素或某些藥物者的精液可呈黃色。藥物可使精液帶有顏色。如果混有大量紅細(xì)胞顏色可為紅色，稱為血精，常見(jiàn)于精囊炎、前列腺炎等生殖系統(tǒng)疾病，也可見(jiàn)于苗勒管囊腫、結(jié)石、腫瘤如前列腺癌、輸精管的微小損害等。二、精液體積WH0推薦稱重法和直接測(cè)量法進(jìn)行精液體積測(cè)定，首選稱重法，精液的密度變化范圍大致在1.043-1.102g/ml。不推薦使用目測(cè)法檢測(cè)精液體積。三、液化時(shí)間精液射出后很快呈典型的半固體凝膠團(tuán)塊，通常在幾分鐘內(nèi)便開(kāi)始液化，通常室溫15min內(nèi)精液標(biāo)本可完全液化，很少超過(guò)60min。超過(guò)60min未液化，稱為精液遲緩液化或精液液化異常。不液化精液按如下方法處理。1.加人等體積的Dulbeco磷酸緩沖液，并反復(fù)吹打，可使某些精液標(biāo)本液化。Dulbeco磷酸鹽緩沖液配制:①Dulbeco葡萄糖-PBs:0.2g氯化鉀（KCl)、0.2g磷酸二氫鉀 （KH2P04)、0.1g氯化鎂（MgCl2.6H20)、8.0g氯化鈉（NaCl)、2.16g磷酸氫二鈉（Na2HP04.7H20)和1.0gD-葡萄糖加人到750ml蒸餾水中。②將0.132g氯化鈣（CaCl2.2H20）溶于10ml蒸餾水中，邊攪拌邊緩慢加人上述溶液中。③用1mol/LNa0H調(diào)節(jié)pH至7.4。④用蒸餾水定容至1000ml。2.精液反復(fù)緩慢地通過(guò)接在注射器上的18號(hào)或19號(hào)鈍性針頭，可降低精液的非均勻狀態(tài)。3.應(yīng)用廣譜蛋白水解酶—菠蘿蛋白酶消化，有助于促進(jìn)精液液化。以上處理可能影響精漿生化、精子活力和精子形態(tài)分析，應(yīng)記錄相應(yīng)操作。精液液化不全常見(jiàn)于前列腺疾病，特別是與前列腺炎有關(guān)。四、pH推薦使用精密pH試紙檢測(cè)，在精液液化后立即測(cè)定，精液放置時(shí)間長(zhǎng)會(huì)影響pH測(cè)定。將一滴混勻的精液在pH精密試紙上均勻展開(kāi)，待浸漬區(qū)顏色變得均勻（30s內(nèi))，讀取pH。五、黏稠度用滴管吸人精液或玻棒插入精液，讓精液依靠自身重力滴落并觀察拉絲的長(zhǎng)度，正常精液形成不連續(xù)的小滴，拉絲長(zhǎng)度大于2cm視為異常。黏稠度增加處理方法同液化不全。六、精子凝集精子凝集特指活動(dòng)精子以不同方式，如頭對(duì)頭、頭對(duì)尾、尾對(duì)尾或混合型，彼此粘在一起的現(xiàn)象。不活動(dòng)精子之間、活動(dòng)精子與黏液絲之間、非精子細(xì)胞成分或細(xì)胞碎片等粘在一起，為非特異性聚集而非凝集。凝集提示可能存在抗精子抗體，但不足以說(shuō)明不育是免疫因素引起的，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。精子凝集程度:1級(jí):零散的，每個(gè)凝集10個(gè)精子，有很多自由活動(dòng)精子。2級(jí):中等的，每個(gè)凝集精子數(shù)為10-50個(gè)，存在自由活動(dòng)精子。3級(jí):大量的，每個(gè)凝集50個(gè)精子，仍有一些自由活動(dòng)精子。4級(jí):全部的，所有的精子凝集，數(shù)個(gè)凝集又粘連在一起。七、精子活力與活動(dòng)率精子的活力即精子的運(yùn)動(dòng)能力。前向運(yùn)動(dòng)精子活力的程度與妊娠率相關(guān)。在精液液化后混勻，取一滴精液置于玻片或?qū)ｉT用于精液分析的計(jì)數(shù)板上，蓋好蓋玻片，系統(tǒng)地觀察至少5個(gè)視野，對(duì)200個(gè)精子進(jìn)行分級(jí)。按WH0（2001）標(biāo)準(zhǔn)分為"a、b、c、d"4級(jí):a級(jí)，快速前向運(yùn)動(dòng)（即37℃時(shí)速度不低于25um/s,或20℃速度不低于20um/s;25um大約相當(dāng)于5個(gè)頭的長(zhǎng)度或半個(gè)尾的長(zhǎng)度）;b級(jí)，慢速或呆滯的前向運(yùn)動(dòng);c級(jí)，非前向運(yùn)動(dòng)（5um/s);d級(jí)，不運(yùn)動(dòng)。精子活動(dòng)率為a+b+c級(jí)精子百分率總和。鑒于技術(shù)人員很難無(wú)偏差地精確界定前向運(yùn)動(dòng)精子活力，使用手工分析時(shí)，WH0-5推薦使用簡(jiǎn)單的分類系統(tǒng)，每個(gè)精子活力按以下分級(jí):前向運(yùn)動(dòng)（PR）:精子主動(dòng)地呈直線或沿一大圓周運(yùn)動(dòng)，不管其速度如何。非前向運(yùn)動(dòng)（NP）:所有其他非前向運(yùn)動(dòng)的形式，如以小圓周泳動(dòng)，尾部動(dòng)力幾乎不能驅(qū)使頭部移動(dòng)，或者只觀察到尾部擺動(dòng)。不動(dòng)（IM）:沒(méi)有運(yùn)動(dòng)。八、精子濃度和總數(shù)每次射精的精子總數(shù)和精子濃度與妊娠時(shí)間和妊娠率有關(guān)，并可預(yù)測(cè)受孕。精子濃度指每單位體積精液中的精子數(shù)目，精液中精子濃度與受精和妊娠率有關(guān)。國(guó)內(nèi)精子手工分析常用的精子計(jì)數(shù)板有Makler、Cel-VU和MicroCel等。有研究表明，Cel-VU計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)結(jié)果最低，最接近標(biāo)準(zhǔn)乳膠珠溶液濃度的參考值，而血球計(jì)數(shù)板和Makler計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)結(jié)果高估。精子總數(shù):精子濃度乘以整份精液體積可以得出精子總數(shù)。精子總數(shù)可以評(píng)價(jià)睪丸產(chǎn)生精子的能力和男性輸精管道的通暢性。以改良牛鮑氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板為例加以說(shuō)明:使用改良牛鮑氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板網(wǎng)格計(jì)數(shù)時(shí)，僅計(jì)數(shù)完整的精子（帶有頭部和尾部)。是否計(jì)數(shù)取決于精子頭部的位置，可忽略精子尾部的位置。方格的邊界由3條線的中間線表示。如精子頭大部分位于兩條內(nèi)側(cè)線中間，計(jì)數(shù)這條精子，如精子頭大部分位于兩條外側(cè)線中間，則不計(jì)數(shù)這條精子。為避免在相鄰的方格里計(jì)數(shù)同一個(gè)精子，精子的頭部位于分隔兩個(gè)相鄰方格的線上，僅當(dāng)此線是兩條互成直角的分界線的其中一條時(shí)，才應(yīng)被計(jì)數(shù)。如有很多無(wú)頭精子的尾部（大頭針狀頭)、或無(wú)尾的精子頭，應(yīng)在報(bào)告中記錄這種情況。必要時(shí)，應(yīng)以與評(píng)估精子濃度相同的方式檢測(cè)它們的濃度，或者通過(guò)染色制片來(lái)確定它們與精子的相關(guān)程度。評(píng)估血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的兩個(gè)計(jì)數(shù)池內(nèi)的精子數(shù)目。如果兩個(gè)計(jì)數(shù)池得出的數(shù)值十分一致，可以認(rèn)為取出的樣本可以代表精液標(biāo)本。精子總數(shù)兩次重復(fù)計(jì)數(shù)可能存在的差異見(jiàn)表16-2。精液稀釋固定液:將50gNaHC03和10ml35%（V/V）甲醛溶液加人1000ml蒸餾水中?？赏瑫r(shí)添加0.25g臺(tái)盼藍(lán)或5ml飽和（4mg/ml)龍膽紫以加深背景顯示出精子頭部。固定液4℃保存。表16-2對(duì)應(yīng)于特定總數(shù)的兩次計(jì)數(shù)之間的可接受差異（引自WH0-5)總數(shù)差異*總數(shù)差異*總數(shù)差異*35-4548-5463-7041-4755-6271-79總數(shù)差異*總數(shù)差異*總數(shù)差異*80-89197-211367-38590-98212-226386-40699-109227-242407-426110-120243-258427-448121-131259-274449-470132-143275-292471-492144-156293-309493-515157-169310-328516-538170-182329-346539-562183-196347-366563-587*:基于95%可信區(qū)間的整數(shù)近似值第三節(jié)精子存活率檢測(cè)精子存活率通過(guò)檢測(cè)精子膜完整性來(lái)評(píng)價(jià)，當(dāng)精子活動(dòng)率低于參考值時(shí)應(yīng)進(jìn)行精子存活率檢測(cè)。通常使用染料拒染法或低滲膨脹試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)精子膜的完整性，從而推測(cè)精子的存活率。染料拒染法基于損傷的細(xì)胞膜、死細(xì)胞膜允許非透過(guò)膜性染料進(jìn)入膜內(nèi)染色。低滲膨脹試驗(yàn)假設(shè)只有細(xì)胞膜完整的細(xì)胞（活細(xì)胞）能夠在低滲溶液中發(fā)生膨脹。一、伊紅-苯胺黑染色法伊紅-苯胺黑染色可提高背景與精子頭間的對(duì)比度，使精子頭更易鑒別。1.伊紅-苯胺黑試劑配制（1）伊紅Y:將0.67g伊紅Y和0.9gNaCl溶解在100ml蒸餾水中，稍加熱。（2）伊紅-苯胺黑:將10g苯胺黑加人100ml伊紅Y溶液中。將懸液煮沸，冷卻至室溫。用濾紙過(guò)濾溶液，除去殘?jiān)湍z狀沉淀物，儲(chǔ)存在深色密封瓶中。2.實(shí)驗(yàn)步驟取50ul精液與等體積的伊紅-苯胺黑液混合，等待30s,制成涂片，空氣干燥，干燥后立即檢查，或非水性永久封固液封片以后再觀察。用亮視野顯微鏡在x1000倍油鏡下檢查。每個(gè)重復(fù)樣本評(píng)估200個(gè)精子。結(jié)果評(píng)定:用亮視野顯微鏡觀察，活精子頭部呈白色，死精子頭部呈紅色或暗粉紅色。頭部呈淡粉紅色的精子認(rèn)為是活精子。如果染色只限于頸部區(qū)域，頭部的其余區(qū)域未染色，這種情況考慮是"頸部膜滲漏"，而不是精子死亡和整個(gè)細(xì)胞膜破裂的征象信號(hào)。這些精子應(yīng)被評(píng)估為活精子。二、伊紅Y染色法1.0.5%伊紅Y試劑配制將5g伊紅Y溶于1000ml0.9%NaCl中。2.實(shí)驗(yàn)步驟（1）將50ul混勻精液和50ul伊紅溶液混合，取10ul上述混合液置于載玻片上。（2）覆蓋22mmx22mm蓋玻片，靜止30s）負(fù)相差顯微鏡在200倍或400倍下觀察)（3）計(jì)數(shù)染色精子（死精子）和非染色精子（活精子）的數(shù)目)（4）每份重復(fù)樣本評(píng)估200個(gè)精子，以達(dá)到可接受的低取樣誤差）計(jì)算重復(fù)玻片的兩個(gè)活精子百分率的平均值和差異，確定差異的可接受性）如果差異太大，重新兩次精液取樣制備兩張新鮮玻片，再次評(píng)估)三、低滲膨脹試驗(yàn)作為染料拒染法的替代試驗(yàn)，低滲膨脹試驗(yàn)（H0s）可以用來(lái)評(píng)估精子的存活率）當(dāng)必須避免精子染色的時(shí)候，這種方法是有用的，如卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（ICsI)選擇精子時(shí)）膜完整的精子在低滲溶液中5min內(nèi)發(fā)生膨脹，在30min內(nèi)所有尾部的形狀是穩(wěn)定的）作為常規(guī)診斷，孵育30min,當(dāng)精子處理用于治療用途時(shí)，孵育5min)1.試劑配制（1）用于診斷目的的膨脹液.0.735g枸橡酸鈉和1.351gD-果糖溶于100ml蒸餾水中）將溶液以1ml分裝，凍存于-20℃)（2）用于治療用途的膨脹液.按1份溶液加1份滅菌蒸餾水，即1:2的比例稀釋溶液）2.實(shí)驗(yàn)步驟 （1）解凍凍存的膨脹液，使用前充分混勻) （2）取1ml膨脹液或1ml1+1（1:2）稀釋溶液，置于一只加蓋的微量離心管中，37℃溫?zé)?min) （3）取100ul混勻精液，加人膨脹液中）用移液管輕輕地吸進(jìn)和排出，加以混勻) （4）37℃孵育5min或30min,取10ul加到潔凈載玻片上，覆蓋22mmx22mm蓋玻片) （5）重新混勻精液標(biāo)本，取重復(fù)樣本與膨脹液混合）制備另一張重復(fù)玻片) （6）使用相差顯微鏡，在x200倍或x400倍視野下檢測(cè)) （7）計(jì)數(shù)未膨脹（死的）和膨脹（活的） （8）每份重復(fù)樣本評(píng)估至少200個(gè)精子，以達(dá)到可接受的低取樣誤差）計(jì)算重復(fù)玻片的兩個(gè)活精子百分率的平均值和差異）如差異太大，重新制備兩張新鮮玻片，再次評(píng)估)a.未膨脹。b.尾尖膨脹。c.尾尖彎曲膨脹。d.尾尖膨脹伴彎曲膨脹。e.尾彎曲膨脹。f.尾粗短膨脹。g.尾完全膨脹。蒸餾水作為低滲膨脹液，膨脹以“g”形為主，低滲膨脹液以“b”-“f”形為主第四節(jié)精子形態(tài)學(xué)分析精子形態(tài)學(xué)分析是評(píng)價(jià)精子受精能力的重要指標(biāo)之一，人工授精或卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射的成功率與正常形態(tài)精子百分率密切相關(guān)。目前WH0-5推薦采用巴氏、shor或Dif-0uik染色法，可以很清楚地區(qū)分精子頂體和核。Dif-0uik方法是將一滴精液加在帶有固定劑和染色劑的載玻片上，因?yàn)檫@種涂片技術(shù)會(huì)導(dǎo)致精子的分布不均勻，可能無(wú)法觀察到形態(tài)學(xué)分類所需細(xì)節(jié)。shor染色可以得到與巴氏染色相近的正常形態(tài)精子百分率。一、涂片的制備一般用新鮮液化精液或生理鹽水洗滌過(guò)的精子懸液制備涂片，每份標(biāo)本作雙份涂片，以防染色或操作出問(wèn)題。由于涂片之間可能存在形態(tài)學(xué)上的顯著性差異，最好對(duì)兩張涂片都進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)估。離心洗滌等技術(shù)操作可能影響精子形態(tài)，如果使用這些方法必須記錄下來(lái)。載玻片應(yīng)潔凈，可用70%乙醇洗滌并干燥后使用，也可用不掉屑的紙巾擦凈。涂片的厚薄應(yīng)根據(jù)精子濃度而定。涂片的方法有多種，WH0-5使用的方法有拉薄技術(shù)和滴管法。拉薄技術(shù)即將一滴精液沿成角度的載玻片后緣展開(kāi)，載玻片向前拖拉，制成涂片;滴管法即對(duì)于已洗滌的精液持移液管水平向前推動(dòng)，將一滴精子懸液沿載玻片的表面展開(kāi)。精液的黏稠度越低，拉薄效果越好，拉薄技術(shù)常常不適用于高黏稠度的精液。涂片在固定及染色之前，應(yīng)空氣干燥至少4h，但不超過(guò)1周。二、巴氏染色法巴氏染色能使精子頭部頂體區(qū)與頂體后區(qū)、過(guò)量殘留胞質(zhì)、尾部的中段與主段染上顏色，適用于精子的形態(tài)學(xué)分析和精液中未成熟生精細(xì)胞和非精子細(xì)胞的檢查。使用巴氏染色制備的精液涂片可以長(zhǎng)期保存。1.原理巴氏染液中的俾士麥棕為鹽基性染料，伊紅、亮綠和橙黃為酸性染料，能與細(xì)胞中具有相反電荷的組分相結(jié)合，而染成各種不同的顏色，從而能清晰地區(qū)別多種細(xì)胞成分。2.試劑①EA-50（表16-3)。②橙黃G6（表16-4)。③無(wú)醋酸Haris蘇木精（表16-5)。④scot溶液:將NaHC033.5g和Mgs04.7H2020.0g溶于1L蒸餾水中。⑤酸性乙醇溶液:300ml99.5%乙醇中加人2.0ml濃HCl,再加人100ml蒸餾水。⑥二甲苯或Rotisol。⑦50%、70%、80%、90%、95%、99.5%乙醇。表16-3EA﹒50的成分伊紅Y俾士麥棕Y亮綠sF蒸餾水95%乙醇磷鎢酸飽和碳酸鋰溶液10g10g10g300ml2000ml4g0.5ml表16-4橙黃G6的成分橙黃G結(jié)晶蒸餾水95%乙醇磷鎢酸10g100ml1000ml0.15g表16-5Haris蘇木精的成分蘇木素95%乙醇AlNH4(s0)4.12H20蒸餾水氧化汞8g80ml160g1600ml6g3.操作①潔凈載玻片用70%酒精洗滌后干燥，滴一小滴精液于載玻片上。②當(dāng)精液黏稠度低時(shí)，用第二張載玻片的邊緣在清潔載玻片表面拖拉一滴精液來(lái)制備薄片，注意涂片不宜太厚。此技術(shù)常常不適宜于精液黏稠的標(biāo)本。另一種方法是滴一滴精液于一張載玻片的中央，然后將第二張蓋玻片表面朝下蓋在其上，使精液在兩玻片間擴(kuò)散，輕拉使兩玻片分開(kāi)即可同時(shí)制得兩張片子。③涂片在空氣中干燥后，用等量95%乙醇和乙醚固定5-15min。④固定好的涂片按表16-6步驟進(jìn)行染色。⑤待染片干燥后，油鏡觀察200個(gè)精子，對(duì)精子形態(tài)進(jìn)行評(píng)估。表16-6巴氏染色步驟溶液操作80%乙醇(V/V)50%乙醇(V/V)蒸餾水Haris或Mayer蘇木精蒸餾水酸性乙醇冷流水沖洗50%乙醇(V/V)80%乙醇(V/V)95%乙醇(V/V)橙黃G695%乙醇(V/V)(3個(gè)缸)EA-5095%乙醇(V/V)(2個(gè)缸)100%乙醇(2個(gè)缸)30s30s30s精確4min30s浸4-8次,每次約1s5min30s30s至少15min1min每缸各浸30s1min每缸各浸30s每缸各浸15s三、精子形態(tài)學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)精子包括頭、頸、中段、主段和末段。通過(guò)光學(xué)顯微鏡很難觀察精子末段，形態(tài)分析主要觀察精子頭 （和頸）和尾（中段和主段)，只有頭和尾都正常的精子才認(rèn)為是正常的。所有處于臨界形態(tài)的精子均歸為異常。1.精子頭部正常精子頭外形光滑、輪廓規(guī)則，大體呈橢圓形。頂體區(qū)清晰分辨，占頭部的40%-70%。頂體區(qū)沒(méi)有大空泡，小空泡不超過(guò)2個(gè)，空泡大小不超過(guò)頭部的20%。頂體后區(qū)不含任何空泡。頭部缺陷主要包括:大頭、小頭、錐形頭、梨形頭、圓頭、無(wú)定形頭、有空泡的頭（超過(guò)2個(gè)空泡，或者未染色的空泡區(qū)域占頭部的20%以上)、頂體后區(qū)有空泡、頂體過(guò)小或過(guò)大的頭（小于頭部的40%，大于頭部70%)、雙頭，或上述缺陷的任何組合。2.精子頸部和中段中段應(yīng)該規(guī)則、細(xì)長(zhǎng)，約與頭部等長(zhǎng)。中段主軸與頭部長(zhǎng)軸成一條直線。殘留胞質(zhì)只有在過(guò)量時(shí)才被認(rèn)為是異常的，即胞質(zhì)超過(guò)了精子頭大小的1/3時(shí)被認(rèn)為過(guò)量殘留胞質(zhì)。胞質(zhì)小滴應(yīng)小于正常頭部1/3。頸部和中段的缺陷主要包括:頸部"彎曲"（頸和尾形成的角度大于頭部長(zhǎng)軸的90%)、中段非對(duì)稱地接在頭部、粗的或不規(guī)則的中段、銳角彎曲、異常細(xì)的中段（即無(wú)線粒體鞘)和上述缺陷的任何組合。3.精子主段主段比中段細(xì)，均一，其長(zhǎng)約45um（約為頭部長(zhǎng)度的10倍)。尾部應(yīng)沒(méi)有顯示鞭毛折斷的銳利折角。主段可以自身卷曲成環(huán)狀。主段缺陷主要包括:短尾、多尾、發(fā)卡形平滑彎曲、銳角彎曲、尾部斷裂、尾部彎曲（90o)、尾部寬度不規(guī)則、卷曲，或上述缺陷的任何組合。4.過(guò)量殘留胞質(zhì)過(guò)量殘留胞質(zhì)是由于精子異常發(fā)生過(guò)程產(chǎn)生的。這類異常精子的特征是含有大量不規(guī)則已染色的細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)的大小超過(guò)精子頭部的1/3，常伴有中段缺陷。四、精子形態(tài)質(zhì)量控制只有帶有尾部的可辨認(rèn)精子，才可進(jìn)行精子形態(tài)分析的計(jì)數(shù)，精子頭脫落或無(wú)精子頭的不作計(jì)數(shù)，無(wú)尾精子亦不作為頭部缺陷計(jì)數(shù)。選擇精子分布不重疊的區(qū)域，在1000倍油鏡下觀察涂片，有順序地對(duì)每個(gè)視野中所有可評(píng)估的精子進(jìn)行分析，不可有選擇地進(jìn)行（圖16-3)。盡管是在另一張同一標(biāo)本涂片上，但也可選擇同一張涂片，重復(fù)評(píng)估至少200個(gè)精子，以達(dá)到可接受的低抽樣誤差。根據(jù)表16-2或圖16-1來(lái)確定差異的可接受性。如果差異值太大，則重復(fù)評(píng)估相同的涂片。圖16-3人類精子形態(tài)異常的示意圖第五節(jié)精液白細(xì)胞檢測(cè)精液的白細(xì)胞主要是多形核白細(xì)胞（PMN,中性粒細(xì)胞)。有時(shí)可通過(guò)巴氏染色方法，將白細(xì)胞與精液涂片的精子細(xì)胞和精母細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。分辨白細(xì)胞主要基于著色、核的大小及形態(tài)的不同。多形核白細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上容易與多核精子細(xì)胞混淆，但是多核型白細(xì)胞染色呈淺藍(lán)色，而精子細(xì)胞呈淺紅色。核的大小也有助于鑒別:單核白細(xì)胞核大小的波動(dòng)范圍較大，從大約7um的淋巴細(xì)胞，到15um的巨噬細(xì)胞。這些大小僅作為參考，因?yàn)橥嘶头至褧?huì)影響核的大小。過(guò)氧化物酶陽(yáng)性的粒細(xì)胞是精液中主要類型的白細(xì)胞，因此過(guò)氧化物酶活性的常規(guī)分析法有助于白細(xì)胞初篩。白細(xì)胞抗原和精子抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定技術(shù)可特異鑒別白細(xì)胞。一、鄰甲苯胺藍(lán)過(guò)氧化物酶染色法（一）試劑1.67mmol/L,pH6.0的磷酸鹽緩沖液將9.47g磷酸氫二鈉（Na2HP04）溶于1000ml蒸餾水中，將9.08g磷酸二氫鉀（KH2P04）溶于另一1000ml蒸餾水中。然后將一種溶液加人到另一種溶液中直至pH為6.0（約12ml的Na2HP04溶液加人到88ml的KH2P04溶液中)。2.飽和氯化銨（NH4Cl)容液將250gNH4Cl加人到1000ml的蒸餾水中。3.148mmol/L的乙二胺四乙酸二納（Na2EDTA）容液將50gNa2EDTA溶人步驟1準(zhǔn)備好的磷酸鹽緩沖液（pH6.0）中。4.底物將2.5mg鄰甲苯胺溶于10ml的0.9%（9g/L）氯化鈉溶液中。5.30%（V/V）過(guò)氧化氫（H202）容液。6.工作液往9ml鄰甲苯胺底物中加人1ml飽和NH4Cl溶液、1ml148mmol/lNa2EDTA溶液及10ul30%（V/V）H202溶液，充分混勻。該溶液配制后可使用24h。（二）步驟1.取0.1ml混勻精液并與0.9ml工作液混合。2.渦旋振蕩精子懸液10s,室溫放置20-30min?；蚴褂迷嚬軗u動(dòng)裝置持續(xù)搖動(dòng)。3.重復(fù)樣本與工作液混勻。取樣前，再次混勻精液標(biāo)本。4.在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上檢測(cè)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。5.20-30min后，再次混勻精子懸液，并將雙份重復(fù)樣本分別充填計(jì)數(shù)板兩側(cè)的計(jì)數(shù)池。6.室溫下將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板水平置于濕盒內(nèi)至少4min,防止干燥，使細(xì)胞沉降。7.用200或400倍鏡的相差顯微鏡檢查計(jì)數(shù)池。8.每份重復(fù)樣本至少計(jì)數(shù)200個(gè)過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞，以達(dá)到可以接受的低取樣誤差。過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕褐色，而過(guò)氧化物酶陰性細(xì)胞不著色。二、全白細(xì)胞CD45免疫細(xì)胞化學(xué)染色釋放顆粒的多形核白細(xì)胞，以及不含過(guò)氧化物酶的其他種類白細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞，不能應(yīng)用檢測(cè)細(xì)胞過(guò)氧化物酶的鄰甲苯胺實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估，但是可以使用免疫細(xì)胞化學(xué)方法來(lái)檢測(cè)。人白細(xì)胞的所有類型表達(dá)一種特異性抗原CD45，故可用抗CD45單克隆抗體來(lái)檢測(cè)不同類型的白細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞或T細(xì)胞等。第六節(jié)計(jì)算機(jī)輔助精子分析計(jì)算機(jī)輔助精子分析（computer-aidedspermanalysis,CAsA）客觀、高效、精度高，容易進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控及室間質(zhì)控。CAsA除可分析精子濃度和活動(dòng)率等精子參數(shù)指標(biāo)外，更能客觀地定量評(píng)價(jià)精子運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)方式，大大克服了傳統(tǒng)測(cè)定方法所存在的費(fèi)時(shí)、信息量少、準(zhǔn)確度差、主觀性高等缺陷。與國(guó)外普遍使用人工分析不同，CAsA的使用情況在中國(guó)相對(duì)較普遍。如果標(biāo)本準(zhǔn)備和儀器使用時(shí)足夠細(xì)心，CAsA在目前可用于一些臨床常規(guī)診斷檢測(cè)，但要建立并維持高標(biāo)準(zhǔn)的儀器操作，質(zhì)量控制必不可少。CAsA分析儀能夠識(shí)別活動(dòng)精子，適宜應(yīng)用于精子動(dòng)力學(xué)分析。很多因素會(huì)影響CAsA分析儀的性能，如標(biāo)本的制備、幀頻率、精子濃度和計(jì)數(shù)池的深度等，因此要做好多方面的質(zhì)量控制。使用前，應(yīng)先對(duì)CAsA分析儀進(jìn)行正確設(shè)置和調(diào)試，以保證設(shè)備良好的工作狀態(tài)。制造商提供了適宜的參數(shù)，但使用者必須檢查分析儀運(yùn)行是否達(dá)到了其所要求的重復(fù)性和可靠性程度，必須使用適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制措施，如錄像帶等。因?yàn)榫拥倪\(yùn)動(dòng)對(duì)溫度敏感，必須將CAsA系統(tǒng)精液標(biāo)本溫度保持在37℃。在精液液化后混勻，取一滴精液置于玻片或?qū)ｉT用于精液分析的計(jì)數(shù)板（Makler或Macro精子計(jì)數(shù)板）上，蓋好蓋玻片，光學(xué)顯微鏡（x400)GH,系統(tǒng)地觀察至少12個(gè)視野，每份標(biāo)本至少要分析200個(gè)活動(dòng)精子的運(yùn)動(dòng)軌跡，最好是400個(gè)。對(duì)每個(gè)標(biāo)本中分析的精子數(shù)目應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。按WH0（2001）標(biāo)準(zhǔn)分為"a、b、c、d"4級(jí):a級(jí)，快速前向運(yùn)動(dòng)（即37℃時(shí)速度不低于25um/s,或20℃速度不低于20um/s;25um大約相當(dāng)于5個(gè)頭的長(zhǎng)度或半個(gè)尾的長(zhǎng)度）;b級(jí)，慢速或呆滯的前向運(yùn)動(dòng);c級(jí)，非前向運(yùn)動(dòng)（5um/s);d級(jí)，不運(yùn)動(dòng)。適宜檢測(cè)精子活力的樣本精子濃度為2x106-50x106/ml。當(dāng)精子濃度50x106/ml時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)高頻度精子碰撞，由此可能產(chǎn)生誤差，此時(shí)應(yīng)進(jìn)行稀釋，并且最好使用該標(biāo)本的精漿稀釋。精液樣本稀釋方法:取一定量精液樣本16000g離心6min,分離上層獲得無(wú)精子的精漿。用無(wú)精子的精漿稀釋最初的精液標(biāo)本，使精子濃度低于50x106/ml。CAsA分析可獲得如下精子運(yùn)動(dòng)參數(shù):①軌跡速度（curyilinearyelocity,VCL）（um/s):也稱曲線速度，為精子頭部沿其實(shí)際行走曲線的運(yùn)動(dòng)速度，即在顯微鏡下見(jiàn)到二維方式運(yùn)動(dòng)軌跡的時(shí)均速率，反映精子活動(dòng)能力。②平均路徑速度（ayeragepathyelocity,VAP）（um/s):精子頭沿其空間平均軌跡的運(yùn)動(dòng)速度，這種平均軌跡是計(jì)算機(jī)將精子運(yùn)動(dòng)的實(shí)際軌跡平均后計(jì)算出來(lái)的，算法因儀器不同而有差異，故不同CAsA系統(tǒng)所得的數(shù)值可能不具可比性。③直線運(yùn)動(dòng)速度（straightlineyelocity,VsL）（um/s):也稱前向運(yùn)動(dòng)速度，即精子頭部直線移動(dòng)的速度。④直線性（linearity,LIN)（%）:也稱線性度，為精子運(yùn)動(dòng)曲線的直線分離度，即VsL/VCL。⑤精子側(cè)擺幅度（amplitudeoflateralheaddisplacement,ALH）（um）:精子頭實(shí)際運(yùn)動(dòng)軌跡對(duì)平均路徑的側(cè)擺幅度，可以是平均值，也可以是最大值。⑥前向性（straightness,sTR)（%）:計(jì)算公式為VsL/VAP,也即精子運(yùn)動(dòng)平均路徑的直線分離度。⑦擺動(dòng)性（wob-bly,W0B)（%）:精子頭沿其實(shí)際運(yùn)動(dòng)軌跡的空間平均路徑擺動(dòng)的尺度，計(jì)算公式為VAP/VCL。⑧鞭打頻率（beatcrosfrequency,BCF)（Hz):也稱擺動(dòng)頻率，即精子頭部跨越其平均路徑的頻率。⑨平均移動(dòng)角度（ayeragemotiondegree,MAD)（度/秒）:精子頭部沿其運(yùn)動(dòng)軌跡瞬間轉(zhuǎn)折角度的時(shí)間平均值。⑩精子運(yùn)動(dòng)濃度:每毫升精液中VAP0um/s的精子數(shù)。第七節(jié)附屬性腺生化指標(biāo)的檢測(cè)檢測(cè)精漿中附屬性腺標(biāo)志性分泌物的含量，可以反映腺體功能，例如，游離左旋肉堿、甘油磷酸膽堿（GPC)、中性a-葡糖苷酶反映附睪功能;果糖和前列腺素反映精囊腺功能;檸檬酸、鋅、y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和酸性磷酸酶反映前列腺功能等。精漿生化測(cè)定的標(biāo)本可-20℃保存待測(cè)，忌反復(fù)凍融。一、精漿中性α-葡糖苷酶測(cè)定精漿中存在兩種a葡糖苷酶的異構(gòu)體，其中中性a-葡糖苷酶僅來(lái)源于附睪;酸性a-葡糖苷酶主要來(lái)源于前列腺，后者可以被十二烷基硫酸鈉（sDs）選擇性抑制，從而可以測(cè)定反映附睪功能的中性a-葡糖苷酶。用澳洲栗精胺（castanospermine）抑制藥阻斷非葡糖苷酶的相關(guān)底物，可使測(cè)試更敏感。精漿酸性a-葡糖苷酶被抑制，中性a-葡糖苷酶將合成的毗喃葡糖苷底物轉(zhuǎn)化為對(duì)硝基苯酚，加人碳酸鈉后變?yōu)辄S色，其顏色深淺與單位時(shí)間內(nèi)精漿中性a-葡糖苷酶活性成正比。檢測(cè)精液中附睪中性a-葡糖苷酶含量有商品化試劑盒。建議使用含sDs和澳洲栗精胺的試劑盒測(cè)定精液中附睪中性a-葡糖苷酶。（一）試劑1.緩沖液緩沖液1（0.2mol/L磷酸緩沖液，pH6.8）:溶解4.56gK2HP04于100ml蒸餾水，另溶解2.72gKH2P04于100ml蒸餾水，將兩者等混合至pH為6.8。緩沖液2:溶解1gsDs于100ml緩沖液1。2.顯色劑顯色劑1（用于終止反應(yīng)，0.1mol/LNa2C03）:溶解6.20gNa2C03.H20于500ml蒸餾水。顯色劑2:溶解0.1gsDs于100ml顯色劑1。3.底物p-硝基苯酚叱響葡糖苷（PNPG)（5mg/ml）溶解0.1gPNPG于20ml緩沖液2，50℃加熱板上攪拌，并振蕩約10min。使用過(guò)程需將溶液保持在37℃。每次測(cè)試需配制新鮮試劑。4.用于精液空白的葡糖苷酶抑制藥（castanospermine,10mmol/L）溶解18.9mg澳洲栗精胺于10ml蒸餾水。用蒸餾水稀釋10倍為1mmol/L的工作液。約1ml分裝，-20℃凍存。5.產(chǎn)物p-硝基苯酚（PNP）的標(biāo)準(zhǔn)曲線（5mmol/L）溶解69.5mgPNP于100ml蒸餾水，必要時(shí)加溫溶液。用鋁箔包裹或裝在棕色玻璃瓶里，4℃避光儲(chǔ)存。每3個(gè)月配制新鮮的標(biāo)準(zhǔn)液。6.制備標(biāo)準(zhǔn)曲線加400ul5mmol/LPNP儲(chǔ)存液于10ml容量瓶中，加顯色劑2定容至10ml（200umol/L)。將200umol/L標(biāo)準(zhǔn)液加顯色劑2稀釋，得到另外4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液:160，120，80和40umol/LPNP。）二）方法1.精液標(biāo)本以2000g離心10min,精漿可保存于-20℃。2.取15ul精漿標(biāo)本分別加人2個(gè)1.5ml試管中。蒸餾水空白。3.向質(zhì)控樣本加人8ul1mmol/Lcastanospermine,作為精漿空白值。4.每管加人37℃的100ulPNPG底物液，37℃孵育2h。5.每管加1ml顯色劑1混勻。405nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，水空白調(diào)零。6.通過(guò)比較吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線（umol/L）上讀取標(biāo)本產(chǎn)生的PNP濃度。乘以校正因子（0.6194)，得到未稀釋精漿中性葡糖苷酶的活性（U/L)。從每份標(biāo)本活性減去精漿澳洲栗精胺活性，得到校正的（相關(guān)的葡糖苷酶）活性。7.精液的葡糖苷酶活性（mU）=校正的葡糖苷酶活性x精液總體積（ml)。兩份重復(fù)測(cè)定結(jié)果的一致性應(yīng)在10%之內(nèi)。如不符，取2份新的精液標(biāo)本樣品，重新檢測(cè)。 （三）精漿果糖測(cè)定果糖與叫味在加熱和強(qiáng)酸的影響下形成了有顏色的復(fù)合物，對(duì)470-490nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，其吸光度與果糖含量成正比。可使用檢測(cè)精漿果糖含量的商品化試劑盒。1.精液標(biāo)本以2000g離心10min,精漿可保存于-20℃。2.取5ul精漿標(biāo)本分別加人50ul蒸餾水中，混勻。3.脫蛋白:加人12.5ul63umol/LZns04和12.5ul0.1mol/LBa（0H）2，混勻。室溫15min,8000g離心5min。4.取50ul上清液移人檢測(cè)管。50ul每種標(biāo)準(zhǔn)液。蒸餾水空白。5.檢測(cè)管加人50ul叫味液，混勻。6.檢測(cè)管加人0.5ml濃鹽酸（HCl,32%V/V)，用實(shí)驗(yàn)室模壓封膜封管口，在通風(fēng)櫥內(nèi)小心地混勻。7.50℃熱水浴20min?；靹?，冰水冷卻15min。470nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，蒸餾水空白調(diào)零。8.結(jié)果乘以稀釋因子16精漿果糖濃度。精液中果糖的總量=果糖的濃度x精液總體積。重復(fù)樣本測(cè)定結(jié)果的一致性應(yīng)在10%之內(nèi)。否則，新取2份重復(fù)精液標(biāo)本，重新檢測(cè)。 （四）精漿鋅的測(cè)定精液中鋅主要來(lái)自前列腺，其含量比血清中高100倍以上，精漿鋅是前列腺的功能指標(biāo)之一。精漿鋅可用化學(xué)比色法測(cè)定。利用化合物2-（5-溴-2-毗啶）-5-（N-丙基-N-硫代丙氨基）-酚（5-溴-PAPs）[2-（5-bromo-2-pyridylazo)-5-（N-propyl-N-sulfopropylamino)-phe-nol（5-Br-PAPs)]與鋅結(jié)合，生成特異性的鋅-色原復(fù)合物，對(duì)560nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，其強(qiáng)度與精漿鋅含量成正比。檢測(cè)血清鋅含量有商品化試劑盒。僅使用顯色劑A和顯色劑B。1.精液標(biāo)本2000g離心10min,取精漿于-20℃待分析。2.取5ul精漿加人300ul蒸餾水，混勻。3.取40ul稀釋精漿樣本于96孔板中，每孔加200ul顯色液，混勻5min。4.在560nm波長(zhǎng)處讀取結(jié)果，用水空白調(diào)零。5.通過(guò)比較吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取標(biāo)本中鋅的濃度。6.結(jié)果乘以稀釋因子61得到精漿鋅濃度。7.精液中鋅的總量=鋅的濃度x精液總體積。重復(fù)樣本測(cè)定結(jié)果的一致性應(yīng)在10%之內(nèi)。即（兩個(gè)估計(jì)值之差除以估值的平均值）x100≤10%。如果不符合，再次取2份重復(fù)精液樣本，重新檢測(cè)。第八節(jié)精子頂體完整率分析精子頂體含有頂體蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、酸性磷酸酶等多種水解酶。在受精時(shí)，精子釋放頂體酶，分解卵子外周的放射冠與透明帶，進(jìn)入卵子內(nèi)。頂體酶還能降低宮頸黏液的黏度，提高精子穿透宮頸黏液的能力。精子頂體分為4型。I型:精子形態(tài)正常，著色均勻，頂體完整，頂體邊緣整齊，有時(shí)可見(jiàn)清晰的赤道板。Ⅱ型:頂體輕微膨脹，精子質(zhì)膜疏松膨大。Ⅲ型:頂體破壞，精子質(zhì)膜嚴(yán)重膨脹破壞，著色淺，邊緣不整齊。N型:頂體全部脫落，精子核裸露。Ⅱ、Ⅲ、N型均為頂體不完整精子，計(jì)算頂體完整率時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算I型頂體精子的百分比。頂體完整率（%）=頂體完整精子數(shù)/精子總數(shù)x100%精子結(jié)合卵透明帶后，在卵透明帶上發(fā)生生理性頂體反應(yīng)。誘發(fā)頂體反應(yīng)后的頂體狀態(tài)檢測(cè)可用熒光標(biāo)記的凝集素（如豌豆凝集素、花生凝集素）或頂體抗原CD46的單克隆抗體，通過(guò)顯微鏡或流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。頂體狀態(tài)熒光檢測(cè)方法如下。一、試劑1.PsA-FITC豌豆凝集素（PsA)，用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記。2.磷酸鹽緩沖液（PBs)，pH為7.4。3.0.9%（9g/L）的氯化鈉溶液。4.95%（V/V）的乙醇溶液。5.PsA儲(chǔ)存液將2mg用FITC標(biāo)記的PsA溶解于4mlPBs中，-20℃保存。PsA工作液:將0.5mlPsA儲(chǔ)存液稀釋于10mlPBs中，儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆茫纱娣?周)。二、精子洗滌1.將0.2ml混勻精液加人10ml生理鹽水中。2.800g離心10min。棄去上清液，留下20-40ul上清液。輕柔吹打，將精子沉淀團(tuán)重懸于留下的上清液中。3.重復(fù)以上精子洗滌操作步驟。4.用生理鹽水將上游后或經(jīng)過(guò)一次密度梯度離心的精子懸液稀釋至10ml。5.重復(fù)步驟2。6.取5ul精子懸液，制成約1cm長(zhǎng)的精子涂片，共做2張重復(fù)涂片。7.在400倍相差顯微鏡下觀察濕涂片。確保精子均勻分布在玻片上，不聚集。8.空氣中干燥玻片。9.95%（V/V）乙醇固定30min。10.空氣中干燥玻片。11.加10mlPsA-FITC工作液到垂直染色缸中。12.將已固定并空氣干燥的涂片浸在PsA-FITC熒光染料中。13.在4℃條件下，染色1h以上。14.用純凈水洗滌每張玻片，并且用可溶于乙醇的封片劑封片。15.結(jié)果評(píng)估:用450-490nm激發(fā)光，于400倍油鏡下觀察精子涂片。精子分類如下。頂體完整（acrosome-intact,AI):精子頭部一半以上熒光染色明亮且均勻。已發(fā)生頂體反應(yīng)（acro-some-reacted,AR）:精子僅在赤道帶出現(xiàn)熒光帶，或者頂體區(qū)根本沒(méi)有熒光染色。頂體異常:除上述兩類精子外的所有其他精子。每張涂片計(jì)數(shù)200個(gè)精子，以達(dá)到可接受的低取樣誤差。計(jì)算2張重復(fù)涂片已發(fā)生頂體反應(yīng)精子百分率的平均值和差異。如果差異太大，則重新評(píng)估。.第九節(jié)抗精子抗體的檢測(cè)精液中的抗精子抗體大多為IgA和IgG,IgM抗體相對(duì)分子質(zhì)量較大在精液中極少發(fā)現(xiàn)。IgA抗體可能比IgG抗體具有更重要的臨床意義。精子表面抗體檢測(cè)可采用直接免疫珠（IB）試驗(yàn)和混合抗體蛋白反應(yīng)（MAR）試驗(yàn)。檢測(cè)精漿、血清、宮頸黏液中抗精子抗體的間接試驗(yàn)可采用間接免疫珠（IB）試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附法（ELIsA）試驗(yàn)。直接免疫珠和混合抗體蛋白反應(yīng)試驗(yàn)采用新鮮精液標(biāo)本，而間接免疫珠試驗(yàn)采用洗滌過(guò)的精子。這兩種試驗(yàn)的結(jié)果并不總是一致，但間接免疫珠試驗(yàn)的結(jié)果與檢測(cè)血清抗體的制動(dòng)試驗(yàn)的結(jié)果相關(guān)性很好。一、