第一章：菌種與種子擴(kuò)展培育微生物工業(yè)用菌種種子擴(kuò)展培育影響種子質(zhì)量的主要要素第一節(jié)微生物工業(yè)用菌種一、微生物的特性有些微生物能在厭氧的條件下生長(zhǎng)有些微生物可以利用簡(jiǎn)單的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物滿足本身的生長(zhǎng)有些微生物能進(jìn)展復(fù)雜的代謝有些微生物能利用較復(fù)雜的化合物有些微生物能在極端的環(huán)境下生長(zhǎng)二、工業(yè)化菌種的要求可以利用廉價(jià)的原料，簡(jiǎn)單的培育基，大量高效地合成產(chǎn)物有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡能夠地簡(jiǎn)單，或者說(shuō)菌種改造的可操作性要強(qiáng)遺傳性能要相對(duì)穩(wěn)定不易感染它種微生物或噬菌體產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必需思索〔在分類學(xué)上最好與致病菌無(wú)關(guān)〕消費(fèi)特性要符合工藝要求放線菌〔鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等〕真菌〔青霉素、頭孢等〕一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌植物或動(dòng)物來(lái)源1、抗生素消費(fèi)有關(guān)的微生物抗生素是次級(jí)代謝產(chǎn)物，需求生物體進(jìn)展復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來(lái)源如下：三、已工業(yè)化產(chǎn)品消費(fèi)菌的引見(jiàn)2、氨基酸消費(fèi)有關(guān)的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有認(rèn)識(shí)地改動(dòng)微生物的代謝途徑，最大限制地積累產(chǎn)物，這種發(fā)酵籠統(tǒng)地稱為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到勝利運(yùn)用。50,60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)開(kāi)展歷史上的一個(gè)轉(zhuǎn)機(jī)點(diǎn)：HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調(diào)理機(jī)制HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶氨基酸消費(fèi)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡(jiǎn)單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸消費(fèi)菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細(xì)菌常規(guī)菌種普通也是以谷氨酸消費(fèi)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌3、食品酶制劑消費(fèi)有關(guān)的微生物開(kāi)發(fā)一個(gè)新酶，都要經(jīng)過(guò)一系列研討的毒理實(shí)驗(yàn)。關(guān)于食品用酶，美國(guó)需求得到FDA的同意。目前已贊同運(yùn)用的僅僅少數(shù)微生物能用于消費(fèi)食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌四、菌種分別與保藏1、菌種分別的普經(jīng)過(guò)程土樣的采取→預(yù)處置→培育→菌落的選擇→產(chǎn)品的鑒定如何使樣品中所含微生物的能夠性大如何在后續(xù)的操作中使這種能夠性實(shí)現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問(wèn)題：2、采樣時(shí)要留意的問(wèn)題氣候、水分、空氣來(lái)源要廣結(jié)合產(chǎn)品的特點(diǎn)標(biāo)簽：地點(diǎn)、時(shí)間、氣候等富集的三種方案：定向培育:采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進(jìn)展培育。3、目的微生物富集的一些根本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì)，使挑選變得能夠。當(dāng)不能夠采用定向培育時(shí)，那么可設(shè)計(jì)在一個(gè)分類學(xué)中思索，不能提供任何有助于挑選產(chǎn)生菌的信息，這時(shí)只能經(jīng)過(guò)隨機(jī)分別的方法定向培育的方法物理方法：加熱、膜過(guò)濾等，表2-2〔P31〕但主要是經(jīng)過(guò)培育的方法定向培育的富集方法1、底物2、pH條件3、培育時(shí)間4、培育溫度等一切能提高目的微生物相對(duì)生長(zhǎng)速度的手段，培育〔固體、液體；分批延續(xù)〕后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì)。4、菌落的選出從產(chǎn)物角度出發(fā)在培育時(shí)以產(chǎn)物的構(gòu)成有目的的設(shè)計(jì)培育基利用簡(jiǎn)單、快速的鑒定方法，如抗生素〔P35〕從形狀的角度菌落的外觀形狀，是微生物的一個(gè)重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐嘤仙L(zhǎng)，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識(shí)別。實(shí)例：堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的挑選〔國(guó)家七五攻關(guān)工程〕采樣〔造紙廠〕→80度30分鐘處置文獻(xiàn):產(chǎn)生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍(lán)＋1%CMC〔羧甲基纖維素〕，pH10.5培育3～4天，選擇有凹陷圈的菌落從285個(gè)土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導(dǎo)型↓例：醛肟水解酶的挑選

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培育基中含0.05%ofZ-PAOx每隔2-3天移去一半培育物，補(bǔ)充新穎培育基不斷分析樣品，2-3個(gè)月后Z-PAOx降低后，稀釋分別條菌落5、目的微生物富集方法的研討進(jìn)展分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段，在微生物鑒別及特定目的產(chǎn)物的挑選方面發(fā)揚(yáng)了著越來(lái)越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術(shù)等目前土壤中可以培育的微生物不到總數(shù)的1%。微生物的多樣性及資源的開(kāi)發(fā)依然是今后假設(shè)干年的研討重點(diǎn)。

2002,陳文新〔科學(xué)院院士〕Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～81六、菌株選育與分子改造目的提高消費(fèi)才干提高產(chǎn)質(zhì)量量開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品處理消費(fèi)實(shí)踐問(wèn)題防止菌種退化方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體交融、基因工程基因的直接進(jìn)化：點(diǎn)突變、易錯(cuò)PCR、同序法DNAShuffling等自然形狀下，堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們消費(fèi)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和消費(fèi)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們消費(fèi)上希望看到的，對(duì)消費(fèi)有利，這種突變成為正突變。1、自然選育自然選育在工業(yè)消費(fèi)上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施?；貜?fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過(guò)程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的喪失，消費(fèi)性能下降，這種情況我們稱為回復(fù)突變問(wèn)題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？自然選育操作步驟：普通習(xí)慣上將自然選育稱為菌種的分別純化。單細(xì)胞(孢子)懸液的制備平板分別挑選單菌落(留意形狀的察看)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)2、誘變育種用各種物理、化學(xué)的要素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)展的挑選，稱為誘變育種誘變劑：可以提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑誘變劑物理在：紫外，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{〔2〕、誘變劑處置過(guò)程中幾個(gè)有關(guān)的問(wèn)題化學(xué)誘變劑運(yùn)用過(guò)程的平安性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇〔1〕、誘變劑的作用原理〔略〕壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH〔3〕、誘變育種的普通步驟(p83)〔4〕、挑選的方法隨機(jī)挑選形狀理性化挑選從產(chǎn)物構(gòu)成的生理生化途徑著手，進(jìn)展有的放矢的挑選。如構(gòu)造類似物抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等，挑選而產(chǎn)生的這些特性，稱為遺傳標(biāo)志。構(gòu)造類似物：在化學(xué)和空間構(gòu)造上和代謝的中間物〔終產(chǎn)物〕類似，因此在代謝調(diào)理方面可以替代代謝中間物〔終產(chǎn)物〕的功能，但細(xì)胞不能以其作為本身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)理機(jī)制HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶構(gòu)造類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營(yíng)養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l3、基因的直接進(jìn)化(directedevolution)突變基因突變庫(kù)的建立挑選基因突變庫(kù)的挑選基因復(fù)制與遺傳步驟：在分子程度上，對(duì)目的基因直接處置，然后經(jīng)過(guò)高通量的挑選方法，提高目的蛋白的性能。七、消費(fèi)用菌種的保藏與復(fù)壯〔一〕、菌種保藏1、概念：根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，人工地發(fā)明條件，使其代謝活動(dòng)處于不活潑形狀。2、不同情況、不同菌種采用不同方法。斜面低溫保藏法〔如酵母菌〕石蠟油封保藏法〔如酵母菌〕砂土保藏法〔如放線菌〕硅膠保藏法冷凍枯燥保藏法〔如普通細(xì)菌〕液氮超低溫凍結(jié)法〔如真菌〕〔二〕、防止菌種衰退的措施〔1〕、菌種的衰退發(fā)酵力的下降繁衍力的下降發(fā)酵產(chǎn)品的得率降低〔2〕、衰退的緣由菌種保藏不妥菌種生長(zhǎng)的要求沒(méi)有得到滿足遇到不利的條件失去某些必要的條件發(fā)生回復(fù)突變〔3〕、防止衰退的方法做好菌種的保藏任務(wù)盡能夠滿足生長(zhǎng)條件盡量減少傳代次數(shù)〔4〕、菌種的分別復(fù)壯普通方法：稀釋平板法或平板劃線法分別單細(xì)胞菌落芽孢桿菌：先將菌液沸水處置數(shù)分鐘，再用平板進(jìn)展分別改動(dòng)培育條件：如單細(xì)胞分別仍效果不佳，可思索改動(dòng)培育溫度條件，以利高產(chǎn)菌株生長(zhǎng)而不利低產(chǎn)菌株生長(zhǎng)前往第二節(jié)種子的擴(kuò)展培育種子擴(kuò)展培育的目的與要求工業(yè)微生物的培育類型種子制備的技術(shù)概要及種子制備實(shí)例影響種子質(zhì)量的要素種子擴(kuò)展培育是指將保管在砂土管、冷凍枯燥管中處休眠形狀的消費(fèi)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)展培育,最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培育物稱為種子。一、種子擴(kuò)展培育的目的與要求種子擴(kuò)展培育的概念:種子擴(kuò)培的目的接種量的需求菌種的馴化縮短發(fā)酵時(shí)間、保證消費(fèi)程度種子的要求：總量及濃度能滿足要求生理情況穩(wěn)定，個(gè)體與群體活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵后，可以迅速生長(zhǎng)無(wú)雜菌污染二、工業(yè)微生物的培育類型培養(yǎng)類型靜置培養(yǎng)通氣培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)表層培養(yǎng)固態(tài)培養(yǎng)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)嫌氣性發(fā)酵好氣性發(fā)酵酒精、丙酮、丁醇、乳酸等固體培養(yǎng)液體深層培養(yǎng)載體培養(yǎng)兩步法液體深層培養(yǎng)前往三、影響種子質(zhì)量的要素〔一〕、種子制備的過(guò)程〔一〕、種子制備的過(guò)程實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培育箱、搖床等實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)設(shè)備，在工廠這些培育過(guò)程普通都在菌種室完成，因此景象地將這些培育過(guò)程稱為實(shí)驗(yàn)室階段的種子培育。消費(fèi)車間階段：種子培育在種子罐里面進(jìn)展，普通在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此籠統(tǒng)地稱這些培育過(guò)程為消費(fèi)車間階段?！捕?、實(shí)驗(yàn)室階段1、培育物選擇的原那么目的：種子擴(kuò)培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點(diǎn)最終的培育物可分為兩類：對(duì)于不產(chǎn)孢子和芽胞的微生物——獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體對(duì)于不產(chǎn)芽孢和孢子的微生物，實(shí)驗(yàn)室階段的種子擴(kuò)培最終是獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培育。獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子菌絲體培育步驟少，因此更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。對(duì)于產(chǎn)孢子的微生物獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體便于操作，但需求更仔細(xì)的控制。2、培育基選擇的原那么培育基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長(zhǎng)，對(duì)孢子培育基應(yīng)該是有利于孢子的生長(zhǎng)。在原料方面，實(shí)驗(yàn)室種子培育階段，規(guī)模普通比較小，因此為了保證培育基的質(zhì)量，培育基的原料普通都比較精細(xì)。3、起始接種物的傳代問(wèn)題細(xì)菌保藏斜面→活化斜面產(chǎn)孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌種的傳代次數(shù)盡能夠的少。母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長(zhǎng)，并去處變異株。所以接種時(shí)要稀一點(diǎn)、便于純化生長(zhǎng)到單菌落。子瓶:大量繁衍，得到大量孢子。接種：①?gòu)哪感泵嫔宵c(diǎn)接種，選取生長(zhǎng)好的單菌落②接種時(shí)密一點(diǎn)，得到大量的孢子。孢子培育時(shí)留意濕度，子斜面運(yùn)用普通不超越1個(gè)月。孢子培育不產(chǎn)孢子的細(xì)菌如谷氨酸棒桿菌和短桿菌，采用斜面營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞保藏法，2~3月移種1次產(chǎn)孢子才干不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種如灰色鏈霉菌和卡那霉菌，可將孢子接入液體培育基中構(gòu)成菌絲體種子?！踩?、消費(fèi)車間階段1、培育物的選擇原那么在消費(fèi)車間階段，最終普通都是獲得一定數(shù)量的菌絲體?？s短發(fā)酵時(shí)間有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果菌絲體比孢子要有利：2、培育基選擇的原那么目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培育基的選擇應(yīng)首先思索的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長(zhǎng)，所以營(yíng)養(yǎng)要比發(fā)酵培育基豐富。在原料方面：不照實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是根本接近于發(fā)酵培育基，這有兩個(gè)方面的緣由:

一是本錢二是馴化例：檸檬酸發(fā)酵以蔗糖為原料成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%瓊脂2%薯干粉成分斜面種子罐發(fā)酵麥芽汁麥汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%瓊脂2%3、發(fā)酵級(jí)數(shù)確實(shí)定谷氨酸：二級(jí)發(fā)酵搖瓶→一級(jí)種子〔小罐〕→發(fā)酵青霉素：三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子〔發(fā)芽罐〕→二級(jí)種子〔繁衍罐〕→發(fā)酵普通由菌絲體培育開(kāi)場(chǎng)計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)，工廠從第一級(jí)種子罐開(kāi)場(chǎng)計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)鏈霉素：四級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子→二級(jí)種子→三級(jí)種子→發(fā)酵發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的根據(jù)級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級(jí)。在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反響級(jí)數(shù)確實(shí)定是非常重要的一個(gè)方面4、接種量確實(shí)定移入種子的體積接種量＝—————————接種后培育液的體積過(guò)大過(guò)小都不好，最終以實(shí)際定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是普通以為大一點(diǎn)好。雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來(lái)源于種子罐，一部分來(lái)源于發(fā)酵罐。P1475、種齡種齡是指種子罐中培育的菌體開(kāi)場(chǎng)移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培育時(shí)間。種齡短：菌體太少；種齡長(zhǎng)：易老化。原那么：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。接種種齡對(duì)堿性蛋白酶產(chǎn)生的影響接種量對(duì)堿性蛋白酶產(chǎn)生的影響6、溫度大多數(shù)微生物的最適生長(zhǎng)溫度：25~37℃不同生長(zhǎng)階段的微生物對(duì)溫度的反響不同。原那么：延遲期處于最適生長(zhǎng)溫度，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期略低于最適生長(zhǎng)溫度，后期主要決議于溶解氧。Q10:在生物學(xué)范圍內(nèi)，溫度每升高10℃，生長(zhǎng)速度加快1倍。7、pH值pH值的作用：影響菌體本身的生命活動(dòng)；影響酶合成方向。培育過(guò)程中發(fā)酵液的pH值會(huì)發(fā)生變化。高碳源培育基傾向于向酸性pH值轉(zhuǎn)移，高氮源培育基傾向于向堿性pH值轉(zhuǎn)移，變化總結(jié)果取決于碳氮比。8、通氣和攪拌通氣量與菌種、培育基的性質(zhì)及培育階段有關(guān)。不同微生物要求通氣量不同，同一菌種在不同生理時(shí)期對(duì)通氣量要求不同培育罐深、攪拌轉(zhuǎn)速大，通氣管開(kāi)孔小或多，培育基粘度小，氧的溶解度大，反之那么小。9、泡沫泡沫構(gòu)成的緣由：機(jī)械攪拌和通氣使液體分散和空氣竄入；代謝活動(dòng)產(chǎn)生的氣泡。泡沫的危害：影響氧的吸收和二氧化碳的排出；降低發(fā)酵罐的有效容量；導(dǎo)致跑料和染菌。消泡措施：機(jī)械消泡，化學(xué)消泡。10、染菌的控制種齡是指種子罐中培育的菌體開(kāi)場(chǎng)移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培育時(shí)間。種齡短：菌體太少；種齡長(zhǎng)：易老化。原那么：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。11、種子的質(zhì)量要求：量：要求到達(dá)一定的濃度質(zhì):形狀〔生優(yōu)點(diǎn)于某個(gè)階段、均勻等等〕理化目的：C、N、P的含量，pH酶活等無(wú)污染四、種子制備過(guò)程舉例〔一〕、谷氨酸消費(fèi)的種子制備制備過(guò)程斜面菌種→一級(jí)種子培育→二級(jí)種子培育→發(fā)酵1、斜面(AS1.299)培育基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5瓊脂2%，pH7.0-7.2培育基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)培育條件：32℃，生長(zhǎng)18-24小時(shí)生長(zhǎng)斜面要求：生長(zhǎng)良好，所運(yùn)用斜面延續(xù)傳代