實(shí)驗(yàn)十二DNA的銜接與轉(zhuǎn)化

1.ＤＮＡ分子的體外銜接2．ＤＮＡ的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的挑選一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘?/p>

當(dāng)我們?cè)?jīng)獲得目的基因片段，選擇好適當(dāng)?shù)目寺　不虮磉_(dá)，轉(zhuǎn)化〕質(zhì)粒載體，并確定重組方案后，下面要進(jìn)展的就是ＤＮＡ片段之間的體外銜接，從而獲得重組子。此重組子可轉(zhuǎn)入相應(yīng)的宿主菌中用于對(duì)目的基因的擴(kuò)增以及目的基因表達(dá)〔如現(xiàn)代基因工程藥物的消費(fèi)〕，還可用于序列分析和轉(zhuǎn)基因等重要生物技術(shù)的研討中。1、ＤＮＡ分子的體外銜接

ＤＮＡ分子的體外銜接就是在一定條件下，由ＤＮＡ銜接酶催化兩個(gè)雙鏈ＤＮＡ片段組鄰的５’端磷酸與３’端羥基之間構(gòu)成磷酸酸脂鍵的生物化學(xué)過程，ＤＮＡ分子的銜接是在酶切反響獲得同種酶互補(bǔ)序列根底上進(jìn)展的。銜接反響中值得留意的幾個(gè)問題：1.ＤＮＡ銜接酶常用的ＤＮＡ銜接酶有兩種：(1)來自大腸桿菌的ＤＮＡ銜接酶(2)來自噬菌體的Ｔ４ＤＮＡ銜接酶。二者的作用機(jī)理類似。Ｔ４ＤＮＡ銜接酶作用機(jī)制Ｔ４銜接酶作用分三步：１．Ｔ４ＤＮＡ銜接酶與輔助因子ＡＴＰ構(gòu)成酶－ＡＭＰ復(fù)合物。２．酶－ＡＭＰ復(fù)合物結(jié)合到具有５’－磷酸基和３’－羥基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。３．產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.2.銜接反響的溫度ＤＮＡ銜接酶的最適反響溫度為３７℃，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折衷方法是１２℃過夜。3.DNA的平未端和粘性末端由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端，因此銜接反響中就有平未端銜接和粘性末端銜接。二者銜接效率不同。粘性末端效率高，因此在底物濃度，酶濃度選擇上是有差別的，4.堿性磷酸酶處置質(zhì)粒載體為了提高銜接效率，普通采取提高ＤＮＡ的濃度，添加重組子比例。這樣就會(huì)出現(xiàn)ＤＮＡ自生銜接問題，為此通常選擇對(duì)質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處置，除去其５’末端的磷酸基，防止環(huán)化，經(jīng)過接反響后構(gòu)成的缺口可在轉(zhuǎn)化細(xì)胞后得以修復(fù)。見以下圖。5.銜接反響的檢測(cè)銜接反響勝利與否，最后的檢測(cè)要經(jīng)過下一步實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化宿主菌，陽性克隆的挑選來確定。我們下面的實(shí)驗(yàn)從粘性末端為例操作。二、實(shí)驗(yàn)試劑１．純化后的酶切質(zhì)粒載體和目的基因。２．１０×Ｔ４ＤＮＡ銜接酶buffer200mMTris-HCl(pH7.6)50mMMgCl250mM二硫芐糖醇500μl/mlBSA３．Ｔ４ＤＮＡ銜接酶４．5mMATP三．實(shí)驗(yàn)方法

ＤＮＡ分子的體外銜接１．在無菌Eppendorf管中參與以下溶液：a.0.1μg質(zhì)粒載體，２倍分子的外源ＤＮＡ。b.加無菌水至7.5μl，于４５℃加溫５分鐘使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。c.參與：１０×Ｔ４ＤＮＡ銜接酶buffer1μlＴ４ＤＮＡ銜接酶0.1Weiss5mMATP1μl２．蓋上管蓋，充分混勻，臺(tái)式離心扣上離心５秒。３．１２℃下過夜銜接反響。４．反響終了后于－２０℃保管。四．結(jié)果與分析

電泳檢查銜接結(jié)果１．如何判別銜接效果的勝利性？問題與討論：１．簡(jiǎn)述Ｔ４ＤＮＡ銜接酶作用機(jī)理。２．簡(jiǎn)述一個(gè)完好外源ＤＮＡ的克隆過程。３．銜接反響中應(yīng)留意些什么問題及如何提高銜接效率。2．ＤＮＡ的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的挑選

一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康募氨尘绑w外經(jīng)過基因工程手段所構(gòu)建的含目的基因的重組質(zhì)粒，選用轉(zhuǎn)化和挑選技術(shù)，可獲得含重組的陽性克隆。在此陽性克隆中，ＤＮＡ可在生物體系中大量擴(kuò)增，繁衍，保管以及表達(dá)目的基因的產(chǎn)物，這是ＰＣＲ體外擴(kuò)增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重組技術(shù)，所獲得的，不同目的需求的陽性菌株已廣泛運(yùn)用于科研，醫(yī)藥消費(fèi)和生物發(fā)酵等領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)由二個(gè)方面組成:1.質(zhì)粒ＤＮＡ轉(zhuǎn)化大腸桿菌。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率的高低與實(shí)驗(yàn)的成敗直接相關(guān)，通常轉(zhuǎn)化效率可達(dá)１０５－１０７轉(zhuǎn)化子/μgDNA。獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)體菌的制備。所謂感受態(tài)，就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理形狀。關(guān)于感受態(tài)的本質(zhì)與存在，說法很多，目前主要有兩種假說：１．部分原生質(zhì)體化假說－－感受態(tài)細(xì)胞的外表構(gòu)成一種能接受ＤＮＡ的酶位點(diǎn)，使ＤＮＡ分子能進(jìn)入細(xì)胞。制備感受態(tài)細(xì)胞如今制備感受態(tài)細(xì)胞通常用CaCl2處置，在低溫中與外來ＤＮＡ分子相混合.ＤＮＡ分子轉(zhuǎn)化分以下幾步:１．吸附－－雙鏈ＤＮＡ分子吸附于受體菌外表；２．轉(zhuǎn)入－－雙鏈ＤＮＡ分子解鏈。一條鏈進(jìn)入受體菌，另一條降解；３．自穩(wěn)－－外源質(zhì)粒ＤＮＡ分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈；４．表達(dá)一供體基因伴隨復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，分裂，轉(zhuǎn)錄翻譯。2.重組子的挑選這和受體菌：質(zhì)粒ＤＮＡ的選擇相關(guān)，原那么上要留意：１．受體菌必需是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株；２．根據(jù)質(zhì)?；蛐秃褪荏w菌基因型互補(bǔ)原那么而定。重組子的挑選方法常用的有兩種方法：１．抗生素挑選法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因〔如氨芐青霉素，卡拉霉素等〕這樣只需轉(zhuǎn)化子才干在含該抗生素的培育基上長(zhǎng)出。本實(shí)驗(yàn)利用抗生挑選轉(zhuǎn)化子。２互補(bǔ)法如今運(yùn)用的許多載體〔如ＰＵＣ系列〕有含有一個(gè)大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酸基因〔lacZ〕的調(diào)控序列和頭１４６個(gè)氨基酸偏碼區(qū)。這個(gè)偏碼區(qū)中插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)。受體菌那么含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。當(dāng)外源基因插入時(shí)，二者溶為一體后，有β－半乳糖苷酶表達(dá)，在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷〔x-gal〕培育基中構(gòu)成蘭色菌落。而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點(diǎn)，從而呵斥插入失活，而使lacZ基因不表達(dá)而構(gòu)成白色菌斑。經(jīng)過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。二、實(shí)驗(yàn)試劑

ＬＢ培育基質(zhì)粒ＤＮＡ〔含Amp抗生基因〕，受體菌CaCl20.1MAmp三．實(shí)驗(yàn)方法一、感受態(tài)細(xì)胞制備１．將宿主菌在瓊脂培育基平板上劃線，３７℃培育１６～２０小時(shí)。２．挑取單菌落轉(zhuǎn)入２０ｍｌＬＢ培育基錐瓶中，３７℃振蕩過夜。３．從中?。玻恚炀恨D(zhuǎn)入５０ｍｌＬＢ培育基中３７℃振蕩培育４－５小時(shí)，測(cè)ＯＤ１００達(dá)０．４～０．５。４．培育物于冰上１０分鐘。５．轉(zhuǎn)入－５０ｍｌ離心管，于４０００ｒｐｍ下４℃離心１０分鐘。６．棄上清，倒置離心管１分鐘，流盡剩余殘液然后參與10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2，置冰上１０分鐘。７．4,000rpm4℃離心１０分鐘，棄上清。８．參與2ml，0.1MCaCl2懸浮細(xì)胞，于４℃過夜。二、轉(zhuǎn)化

１．在1.5mlEppendorf管中參與２００μl感受態(tài)細(xì)胞和１０μl40ngDNA溶液，溫暖混勻，于冰上３０分鐘。２．于４２℃水?。梗懊?。３．冰?。卜昼?。４．參與８００μlＬＢ液體培