WB過程中的常見問題及處理方法編輯課件WB的簡(jiǎn)介WB即蛋白質(zhì)印跡法〔WesternBlot〕。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。

編輯課件根本原理通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。編輯課件

應(yīng)用1.目的蛋白的表達(dá)特性分析2.目的蛋白與其它蛋白的互作3.目的蛋白的組織定位4.目的蛋白的表達(dá)量分析編輯課件編輯課件編輯課件編輯課件三、WB的影響因素步驟較多，任何一步都可能影響結(jié)果1、電泳別離蛋白蛋白抽提；蛋白定量；樣品制備變性；上樣量；電泳〔電壓、電流的大小，膠濃度、制膠〕編輯課件2、轉(zhuǎn)膜膜的選擇；膜確實(shí)認(rèn)；特殊處理；……編輯課件3、封閉封閉液的選擇；封閉條件優(yōu)化；……編輯課件4、漂洗漂洗液的配制與選擇漂洗時(shí)間及次數(shù)編輯課件5、抗體孵育抗體及稀釋液選擇；抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化；抗體孵育時(shí)間；……編輯課件6、曝光曝光時(shí)間的掌控編輯課件四、本卷須知1.蛋白樣品的提取盡可能新鮮組織或蛋白防止反復(fù)凍融對(duì)于有些蛋白，加去磷酸化的〔NaF〕盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子〔通過參加核酸酶或采取不同提取策略〕選擇適宜的裂解液準(zhǔn)確定量〔BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白〕

編輯課件編輯課件2、制膠根據(jù)不同的蛋白大小，選擇不同的濃度制膠。編輯課件制膠的時(shí)候一定要注意玻璃板一定要干凈，不能有殘留的膠。玻璃板底部放平，盡量不能漏膠灌膠的時(shí)候，不能太快，容易產(chǎn)生旋窩水或異丙醇?jí)旱臅r(shí)候，不能太久編輯課件

3、轉(zhuǎn)膜a泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移液浸泡20min；凝膠假設(shè)是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會(huì)在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形bPVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡，活化編輯課件c膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板，不能放反d轉(zhuǎn)膜過程產(chǎn)生大量的熱，注意冷卻e具體轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，反之那么短f防止直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因?yàn)槭稚系牡鞍缀陀椭瑫?huì)影響轉(zhuǎn)膜效率并會(huì)使膜臟掉。編輯課件g夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否那么會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全h保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過大和過小都會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效率i一定要注意膜的保濕，防止膜的枯燥，否那么極易產(chǎn)生較高的背景編輯課件4、封閉a脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用，因?yàn)槊撝谭酆刑堑鞍缀蜕锼豣如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因?yàn)榱姿崦概c印記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化c檢測(cè)磷酸化抗體時(shí)，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑編輯課件5、孵育a洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；b注意一抗二抗的匹配c一抗二抗的效價(jià)問題編輯課件五、常見問題及解決電泳中的問題︶條帶呈笑臉狀——凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好;——電泳系統(tǒng)溫度偏高編輯課件︵條帶呈皺眉狀可能是由于裝置不適宜，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全編輯課件拖尾樣品溶解不好編輯課件紋理〔縱向條紋〕樣品中含有不溶性顆粒編輯課件條帶偏斜電極不平衡或者加樣位置偏斜編輯課件條帶兩邊擴(kuò)散加樣量過多編輯課件

Westernblot結(jié)果曝光問題

背景過高且不均勻1、封閉不充分——延長(zhǎng)封閉時(shí)間；——更換適宜的封閉劑〔脫脂奶粉，BSA，血清等〕2、一抗?jié)舛冗^高——增加一抗稀釋倍數(shù)；3、抗體孵育溫度過高——4℃孵育編輯課件4、二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反響——設(shè)置二抗對(duì)照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?、洗膜不充分——增加洗滌次數(shù)，增加洗膜次數(shù)編輯課件沒有陽性條帶或很弱1、一抗、二抗等不匹配訂購(gòu)試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物。可通過設(shè)置內(nèi)參可以驗(yàn)證二級(jí)測(cè)系統(tǒng)的有效性更換更好的一抗二抗編輯課件2、一抗或/和二抗?jié)舛鹊驮黾涌贵w濃度；長(zhǎng)孵育時(shí)間；編輯課件3、封閉劑與一抗或二抗有交叉反響封閉時(shí)使用溫和的去污劑，如TWEEN20更換封閉劑〔常用的脫脂奶、BSA、血清或明膠〕編輯課件4、樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過設(shè)置陽性對(duì)照，如果陽性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有那么可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標(biāo)本上樣量至少每孔20-30ug蛋白,樣本制備時(shí)使用蛋白酶抑制劑,或分級(jí)提取目編輯課件5、轉(zhuǎn)膜不充分,或洗膜過度使用麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果,PVDF膜需浸透,需正確的轉(zhuǎn)膜操作