4.4核酸和核苷酸的性質(zhì)(Section4PropertiesofNucleicacidandNucleotide)一、溶解性〔Solubility〕①RNA、Nt、Ns和Base純品為白色粉末或結(jié)晶體。②DNA為纖維狀固體。③核酸為極性物質(zhì)，核苷酸和核苷可溶于水。④核酸大多與蛋白質(zhì)結(jié)合成和蛋白。在不同的鹽濃度下，DNA蛋白〔DNP〕和RNA蛋白〔RNP〕溶解度不同。

1核蛋白+1mol/LNaCI→DNP溶解+RNP↓核蛋白+0.141mol/LNaCI→DNP↓+RNP溶解(低鹽DNP不溶，高鹽RNP不溶)核蛋白在pH4.2〔pH=pI〕時，DNP↓，RNP溶解核蛋白在pH2～2.5〔pH=pI〕時，RNP↓，DNP溶解二、核酸及其組分的兩性性質(zhì)1.堿基解離，第一位都在N上,解離位點：A：在N1解離，G：在N7解離，U：在N3解離，T：在N3解離，C：在N3解離，22.核苷〔Ns〕解離糖的存在使N解離pK值降低，而糖上－OH的解離無足輕重〔pK在12以上〕3.核苷酸〔Nt〕解離Pi有兩次解離，pK′＝0.7～1.6pK′＝6.1～6.5Nt含堿基和Pi，為兩性電解質(zhì)，當(dāng)正、負解離速度相等時，該pH即為pI，〔U、T除外,不帶電荷〕pI=(pK′+pK′)/2，pK′為Pi第一解離，pK′為N解離eg.AMPpI=(0.9+3.8)/2=2.35了解Nt的解離及pI，在制備及分析中極有幫助。IPα2IPIPα2IIP32.核苷〔Ns〕解離糖的存在使N解離pK值降低，而糖上－OH的解離無足輕重〔pK在12以上〕3.核苷酸〔Nt〕解離Pi有兩次解離，pK′＝0.7～1.6pK′＝6.1～6.5Nt含堿基和Pi，為兩性電解質(zhì)，當(dāng)正、負解離速度相等時，該pH即為pI，〔U、T除外,不帶電荷〕pI=(pK′+pK′)/2，pK′為Pi第一解離，pK′為N解離eg.AMPpI=(0.9+3.8)/2=2.35了解Nt的解離及pI，在制備及分析中極有幫助。IPα2IPIPα2IIP44、核酸分子的解離〔Dissociation〕核酸和多核苷酸鏈除了末端磷酸殘基外，磷酸二酯鍵中磷酸殘基只有一個解離常數(shù)，pK1=1.5三、紫外吸收(260nm，定性和定量分析)但分子量差異大，純質(zhì)不一，難以用NA重量濃度來表示其消光系數(shù)，故常用摩爾磷消光系數(shù).ε(p)—每升溶液中含1mol磷的核酸溶液〔pH=7〕的消光系數(shù)。260nm:DNA=7,000～10,000RNA=6,000～8,0005四、核酸的變性與復(fù)性〔DenaturationandrenaturationofNA〕〔一〕DenaturationofNA①定義:NA受熱、酸堿、有機溶劑、輻射、及尿素等變性劑作用，皆引起變性，所謂變性：氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，從而引起紫外｛ε(p)｝增加〔hyperchromieeffect，增色效應(yīng)〕、失去生物活性、粘度下降〔雙股－無規(guī)線團〕〔與pr反〕、比旋下降等性質(zhì)改變的過程叫變性。(與降解不同，無共鍵的斷裂)8DNA的變性(denaturation)變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸堿滴定曲線改變；生物活性改變DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂9增色效應(yīng)：DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。10

用途：a.作為判斷變性，復(fù)性的指標(biāo)變性－h(huán)yperchromiceffect〔增色效應(yīng)，ε(p)〕復(fù)性－h(huán)ypochromiceffect〔減色效應(yīng)，ε(p)〕b.測NA濃度〔常用〕②熱變性及變性溫度熱引起…變性溫度(Tm)—紫外吸收值達最高值的一半時溶液所處的溫度(突發(fā)過程，相當(dāng)窄的溫度)?；螂p螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度〔meltingtemperature，溶解溫度，解鏈溫度〕。DNA，Tm=70～85oC。DNA變性Tm與以下因素有關(guān)：11

●樣品均一性越均一，溫度越窄。是均一性的檢驗標(biāo)準(zhǔn)

●溶液離子強度增高，Tm值增加●G－C含量pH7.0，0.165MNaCl中DNA的Tm值與G－C含量成正比。其它條件亦相似?？捎孟旅婀接嬎鉍-C百分含量：

G－C％＝〔Tm－69.3〕×2.44如某DNATm值在pH7.0、0.165MNaCl中為80oCG－C〔％〕＝10.7×2.44=26.112當(dāng)DNA的稀鹽溶液加熱到80-100℃時，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開，形成無規(guī)線團。

8090100100%50%OD260（254）

Tm

變性溫度范圍①②③℃融解溫度〔meltingtemperature,Tm〕：DNA熱變性過程中，紫外吸收到達最大值的一半時溶液的溫度稱為融解溫度〔Tm〕或解鏈溫度、變性溫度。實驗室常用的方法——熱變性13〔1〕變性后理化性質(zhì)改變DNA溶液的粘度降低浮力密度增加旋光偏振光改變紫外吸收增加〔高色效應(yīng)〕高色效應(yīng)〔hyperochromiceffect〕：DNA變性后，在260nm處的紫外吸收增高，稱為高色效應(yīng)或增色效應(yīng)。〔2〕變性后的DNA一級結(jié)構(gòu)沒有改變?？偨Y(jié)：14〔3〕融解溫度〔meltingtemperature,Tm〕：DNA熱變性過程中，紫外吸收到達最大值的一半時溶液的溫度稱為融解溫度〔Tm〕GC含量越高，Tm越大DNA越長，Tm越大溶液離子強度增高，Tm值增加DNA越純，相變范圍越小

15

減色效應(yīng)〔hypochromiceffect〕:DNA復(fù)性時，其溶液OD260降低。16

復(fù)性速度常用Cot1/2表示Co：變性DNA濃度(以Ntmol數(shù)表示)；t：復(fù)性時間〔秒〕。Cot1/2表示DNA復(fù)性50％所需時間與DNA濃度的乘積。17在DNA變性后的復(fù)性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件〔溫度及離子強度〕下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交(hybridization)18核酸的雜交1920DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來源的DNA分子21核酸探針〔nucleicacidprobe〕:能特異性的探測帶某一特定序列的DNA或RNA分子的標(biāo)記核酸分子。22

核酸分子雜交(hybridization)由不同來源的核酸單鏈形成雜化雙鏈的過程234.5Nt類物質(zhì)的制備及應(yīng)用一、核酸組分Nt、Ns和Base的制備〔一〕降解方法①酸解NA，直接得堿基〔或無嘌呤酸〕，糖苷鍵斷。Pu>Py〔purine〕〔pyrimidine〕；deoxy>oxy②堿解RNA〔0.3～1MNaOH〕，得2',3'環(huán)式Nt，進一步生成2′或3'Nt、Ns(Nt代表核苷酸，Ns代表核苷的縮寫〕DNA無2'-OH，不能生成2',3'環(huán)式Nt，相對抗堿。

24③酶解限制性內(nèi)切酶類，以后再講。外切酶類1.牛脾磷酸二酯酶作用方式:5'-3'外切底物:RNA，DNA，5'-OH專一，3'斷裂產(chǎn)物:3'Nt2.蛇毒磷酸二酯酶作用方式:3'-5'外切底物:RNA，DNA，3'-OH專一，5'斷裂產(chǎn)物:5'Nt?！才c桔青酶磷酸二酯酶同〕25〔三〕應(yīng)用1.研究用試劑肌苷用于血液保存，2.強力味精〔鳥苷酸，肌苷酸與味精混合，鮮味增加幾十倍〕3.ATP，GTP改善代謝功能；5－FU抗癌作用；聚肌胞=聚肌苷、聚胞苷，抗病毒，是干擾素誘導(dǎo)劑〔肝炎〕……26二、PrperationofNA〔DNAandRNA〕

〔一〕制備NA時注意的幾個問題①防止核酸酶的水解加核酸酶抑制劑或去核酸酶激活劑。②防止化學(xué)因素的降解提取NA常用酸堿法，但要防止過酸過堿。③防止物理因素的降解高溫、機械等作用力破壞NA結(jié)構(gòu)，應(yīng)該在低溫和溫和條件下進行。27〔二〕DNA的制備①辛醇－氯仿法Et-OHDNA〔水相〕DNA↓核蛋白溶液＋辛醇－氯仿Pro〔水與氯仿相之間〕②SDS法SDS將Pro變性，與DNA別離③苯酚法苯酚將Pro變性，抑制Nuclease活性?；钚訢NA在水相↓28〔三〕RNA的制備①粗提方法：苯酚法；稀堿或鹽溶液〔與pI聯(lián)合使用〕。提取不同RNA時，先用離心法別離細胞器，再提取相應(yīng)的RNA。如rRNA從核糖體中提取，tRNA從細胞質(zhì)中提取，mRNA從多聚核糖體中提取。②精制方法：分子篩層析，密度梯度離心，DEAE-Sephadex，PolydT親和柱(精制mRNA，與mRNA尾巴PolyA特異結(jié)合)等。

29

30

消化定磷試劑NA(DNA和RNA)+H+有機磷轉(zhuǎn)化為無機磷藍色產(chǎn)物〔總磷，A650nm～660nm〕核酸磷真實含量＝總磷－無機磷純核酸含磷量約9.5%，1g磷＝10.5g核酸〔100/9.5〕〔四〕瓊脂糖凝膠電泳法〔尤其用于DNA測定和分析〕DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳〔加溴乙錠，插入DNA中使熒光增強〕,熒光強度與DNA含量正比。與標(biāo)準(zhǔn)品對照可測定樣品中DNA的量。31

二、NA純度分析方法：測定雙鏈和單鏈DNA的吸收光譜；雙鏈向單鏈轉(zhuǎn)化過程中的光吸收增加〔增色效應(yīng)〕三、DNA的PAGE①測定DNA、片斷和基因的相對分子量大小。常用標(biāo)準(zhǔn)分子量的DNA作對照，計算樣品DNA的分子大小。②鑒別分子量相同，但構(gòu)象不同的DNA在PAGE中的遷移率大?。撼菪汀睸C)>線形分子〔L〕>開環(huán)狀分子〔OC〕32

四、核酸分子雜交〔Hybridization〕熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時并不一定與同源DNA互補鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。DNA單鏈與互補的RNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。經(jīng)典方法：〔現(xiàn)在少用〕〔1〕RNA用同位素標(biāo)記〔2〕與變性DNA在0.9MNaCl，0.09M乙酸鈉中66℃，保溫24hr。〔3〕RNase除去未結(jié)合RN