第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種遺傳：親代與子代相似變異：親代與子代、子代間不同個體不完全相同遺傳（inheritance）和變異（variation）是生命的最本質(zhì)特性之一遺傳型（genotype）：表型（phenotype）：生物的全部遺傳因子所攜帶的遺傳信息具有一定遺傳型的個體，在特定環(huán)境條件下通過生長發(fā)育所表現(xiàn)出來的外表特征和內(nèi)在特征的總和。表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關(guān)。第八章微生物遺傳與育種遺傳和變異的幾個概念:變異（Variation）是生物體在某種外因或內(nèi)因作用下引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，亦即遺傳型的改變。特點：幾率極低(一般為10-5~10-6)；性狀變化幅度大；變化后的新性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。第八章微生物遺傳與育種細菌變異變異(variation)：在一定條件下，子代與親代之間以及子代與子代之間的生物學(xué)性狀出現(xiàn)的差異。形態(tài)結(jié)構(gòu)的變異毒力變異耐藥性變異菌落變異第八章微生物遺傳與育種一.形態(tài)結(jié)構(gòu)的變異細菌的大小和形態(tài)在不同的生長時期可不同，生長過程中受外界環(huán)境的影響也可發(fā)生變異。如：鼠疫耶氏菌在陳舊培養(yǎng)物上細菌的多形態(tài)性、細菌L型。細菌的特殊結(jié)構(gòu)如：莢膜（肺炎鏈球菌）芽胞（炭疽芽孢桿菌）鞭毛（變形桿菌H-O變異）也可發(fā)生變異。第八章微生物遺傳與育種形態(tài)結(jié)構(gòu)變異

3-6%食鹽

鼠疫桿菌────→多形態(tài)性(衰殘型)。

瓊脂培基

第八章微生物遺傳與育種形態(tài)結(jié)構(gòu)變異

青霉素、溶菌酶

正常形態(tài)細菌──────→L型變異抗體或補體

(部分或完全失去胞壁)

正常霍亂弧菌霍亂弧菌L型第八章微生物遺傳與育種毒力變異(增強)無毒力的白喉棒狀桿菌常寄居在咽喉部，不致病；當感染了β-棒狀噬菌體后變成溶原性細菌，則獲得產(chǎn)生白喉毒素的能力，引起白喉。

β棒狀噬菌體

白喉棒狀桿菌────→獲得白喉毒素第八章微生物遺傳與育種毒力變異(減弱)有毒菌株長期在人工培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，可使細菌的毒力減弱或消失。卡介苗(BCG)是有毒的牛分枝桿菌在含有膽汁的甘油、馬鈴薯培養(yǎng)基上，經(jīng)過13年，連續(xù)穿230代，獲得的一株毒力減弱但仍保持免疫原性的變異株。

膽汁、甘油、馬鈴薯培養(yǎng)基

牛型結(jié)核桿菌────────→卡介苗

13年(230代)第八章微生物遺傳與育種耐藥性變異細菌對某種抗菌藥物由敏感變?yōu)槟退幍淖儺悺＝瘘S色葡萄球菌耐青霉素的菌株已從1946年的14%上升至目前的80%。多重耐藥性：有些細菌還表現(xiàn)為同時耐受多種抗菌藥物，

含鏈霉素培基

痢疾桿菌─────→依鏈株(耐藥菌株)

長期培養(yǎng)

從抗生素廣泛應(yīng)用以來，細菌對抗生素耐藥的不斷增長是世界范圍內(nèi)的普遍趨勢，給臨床治療帶來很大的困難，并成為當今醫(yī)學(xué)上的重要問題。第八章微生物遺傳與育種菌落變異細菌的菌落主要有光滑(smooth,S)型和粗糙(rough,R)型兩種。S型菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊。經(jīng)人工培養(yǎng)多次傳代后菌落表面邊為粗糙、干燥、邊緣不整齊，稱S—R變異。

在陳舊培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)

光滑型菌落─────→粗糙型菌落

S

或在有免疫力的人體內(nèi)

R第八章微生物遺傳與育種R型菌落S型菌落第八章微生物遺傳與育種突變(mutation)：是細菌遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變，導(dǎo)致細菌性狀的遺傳性變異遺傳性變異：非遺傳性變異：第八章微生物遺傳與育種遺傳性變異：是細菌的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，故又稱基因型變異。常發(fā)生于個別的細菌，不受環(huán)境因素的影響，變異發(fā)生后是不可逆的，產(chǎn)生的新性狀可穩(wěn)定地遺傳給后代。非遺傳性變異：細菌在一定的環(huán)境條件影響下產(chǎn)生的變異，其基因結(jié)構(gòu)未改變，稱為表型變異。易受到環(huán)境因素的影響，凡在此環(huán)境因素作用下的所有細菌都出現(xiàn)變異，而且當環(huán)境中的影響因素去除后，變異的性狀又可復(fù)原，表型變異不能遺傳。第八章微生物遺傳與育種表型飾變：表型的差異只與環(huán)境有關(guān)特點：暫時性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個體的行為橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳。遺傳型變異（基因變異、基因突變）：遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致表型改變特點：遺傳性、群體中極少數(shù)個體的行為（自發(fā)突變頻率通常為10-6-10-9）Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens(粘質(zhì)沙雷氏菌,靈桿菌).

Fromlefttoright:slantculturegrownat25°C,slantculturegrownat37°C,brothculturegrownat25°C,brothculturegrownat37°C.

第八章微生物遺傳與育種微生物是遺傳學(xué)研究中的明星：微生物細胞結(jié)構(gòu)簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。對環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強。第八章微生物遺傳與育種第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)一、三個證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實驗二、RNA作為遺傳物質(zhì)三、朊病毒的發(fā)現(xiàn)與思考四、遺傳物質(zhì)在微生物細胞內(nèi)存在的部位和方式第八章微生物遺傳與育種1經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（transformation）F.Griffith，研究對象：Streptococcuspneumoniae（肺炎雙球菌）SIII型菌株：有莢膜，菌落表面光滑，有致病性

RII型菌株：無莢膜，菌落表面粗糙，無致病性一、三個證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實驗第八章微生物遺傳與育種1928年，F(xiàn).Griffth作了3組實驗:第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種1944年，Avery精確重復(fù)了轉(zhuǎn)化實驗，確定了轉(zhuǎn)化因子DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。這就說明，S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的，決不是某一遺傳性狀的本身，而是以DNA為物質(zhì)基礎(chǔ)的遺傳因子DNA+DNA以外的酶第八章微生物遺傳與育種2噬菌體感染實驗A.D.Hershey和M.Chase，1952年第八章微生物遺傳與育種10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體沉淀中含25%放射性上清液中含75%放射性用35S（蛋白質(zhì)外殼）的噬菌體感染實驗（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中所以，進入細胞的是噬菌體的核酸而不是蛋白質(zhì)。第八章微生物遺傳與育種3植物病毒的重建實驗第八章微生物遺傳與育種選用TMV和霍氏車前花葉病毒（HRV），分別拆分取得各自的RNA和蛋白質(zhì)，將兩種RNA分別與對方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒：（1）RNA（TMV）-

蛋白質(zhì)（HRV）（2）RNA（HRV）-

蛋白質(zhì)（TMV）用兩種雜合病毒感染寄主：（1）表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常TMV粒子（2）表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常HRV粒子。上述結(jié)果說明，在RNA病毒中，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸。第八章微生物遺傳與育種二、RNA作為遺傳物質(zhì)生化提取分別獲得含RNA的煙草花葉病毒蛋白質(zhì)外殼（病毒1）和核酸（病毒2）抗血清處理，證明雜種病毒的蛋白質(zhì)外殼來自病毒1，而非病毒2雜種病毒的后代的蛋白質(zhì)外殼表現(xiàn)為病毒2，而非病毒1遺傳物質(zhì)是核酸（RNA）而非蛋白質(zhì)第八章微生物遺傳與育種三、朊病毒的發(fā)現(xiàn)和思考朊病毒含有微量的核酸，仍未發(fā)現(xiàn)？朊病毒僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成朊病毒的遺傳物質(zhì)為蛋白質(zhì)？第八章微生物遺傳與育種三、朊病毒的發(fā)現(xiàn)與思考亞病毒的一種：具有傳染性的蛋白質(zhì)致病因子，迄今為止尚為發(fā)現(xiàn)該蛋白內(nèi)含有核酸。其致病作用是由于動物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)PrPc改變折疊狀態(tài)為PrPsc所致，而這二種蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)并沒有改變。第八章微生物遺傳與育種人的庫魯病(kuru)、克雅氏病(CreutzfeldtJakobdisease,CJD)等羊搔癢癥(scrapie)牛海綿狀腦病(spongiformencephalopathy)第八章微生物遺傳與育種引起人與動物的致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病第八章微生物遺傳與育種Prusiner(1982)提出羊搔癢病因子是一種蛋白質(zhì)侵染顆粒（proteinaceousinfectiousparticle），并將之稱做Prion或Virino。

-------朊病毒1997年，StanleyB.Prusiner榮獲諾貝爾獎第八章微生物遺傳與育種四、遺傳物質(zhì)在微生物細胞內(nèi)存在的部位和方式細胞水平細胞核水平染色體水平核酸水平基因水平密碼子水平核苷酸水平第八章微生物遺傳與育種細胞水平真核微生物：細胞核原核微生物：核區(qū)細胞核或核區(qū)的數(shù)目在不同的微生物中是不同的第八章微生物遺傳與育種細胞核水平真核生物細胞核核染色體原核生物核區(qū)DNA鏈核基因組在核基因組之外，還存在各種形式的核外遺傳物質(zhì)第八章微生物遺傳與育種細胞核水平核外染色體真核生物的“質(zhì)粒”原核生物的質(zhì)粒

細胞質(zhì)基因 （質(zhì)體）

共生生物酵母菌的2m質(zhì)粒F因子R因子Col質(zhì)粒Ti質(zhì)粒巨大質(zhì)粒降解性質(zhì)粒線粒體葉綠體第八章微生物遺傳與育種染色體水平染色體是由組蛋白與DNA構(gòu)成的線狀結(jié)構(gòu)染色體的數(shù)目在不同的生物中是不同的染色體的倍數(shù)在同一生物的不同生活時期是不同的第八章微生物遺傳與育種核酸水平核酸種類：DNA，RNA核酸結(jié)構(gòu)：雙鏈、單鏈；環(huán)狀，線狀，超螺旋狀DNA長度：因種而異微生物基因組測序工作是在人類基因組計劃的促進下開始的，最開始是作為模式生物，后來不斷發(fā)展，已成為研究微生物學(xué)的最有力的手段。第八章微生物遺傳與育種基因水平原核生物基因系統(tǒng)

操縱子啟動子（基因）操縱子（基因）結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因原核生物與真核生物基因組的比較比較項目原核微生物真核微生物基因組大小染色體數(shù)目染色體組形狀染色體與組蛋白結(jié)合基因連續(xù)性重復(fù)序列不編碼序列操縱子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯部位小一般1個環(huán)狀無強少少普遍存在同在細胞質(zhì)中進行大多個線狀有穩(wěn)定的結(jié)合差（被許多內(nèi)含子分隔）多多一般沒有在核中轉(zhuǎn)錄，細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)譯第八章微生物遺傳與育種操縱子(operon)的轉(zhuǎn)錄機制蛋白質(zhì)因子特異DNA序列編碼序列啟動序列操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)第八章微生物遺傳與育種密碼子水平第八章微生物遺傳與育種核苷酸水平核苷酸是最小突變單位和交換單位第八章微生物遺傳與育種第二節(jié)微生物的基因組結(jié)構(gòu)一、概念基因組（genome）：一個物種的單倍體的所有染色體及其所包含的遺傳信息的總稱原核生物（如細菌），多為單倍體（在一般情況下只有一條染色體）真核微生物，多條染色體，例如啤酒酵母有16條染色體。有時為雙倍體第八章微生物遺傳與育種二、微生物基因組結(jié)構(gòu)的特點1、原核生物（細菌、古生菌）的基因組a）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；鏈環(huán)狀的染色體在細胞中以緊密纏繞成的較致密的不規(guī)則小體形式存在于細胞中，該小體稱為擬核(nucliod)，其上結(jié)合有類組蛋白蛋白質(zhì)和少量RNA分子，使其壓縮成一種手腳架形的致密結(jié)構(gòu)。第八章微生物遺傳與育種1、原核生物（細菌、古生菌）的基因組a）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；b）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性；基因數(shù)基本接近由它的基因組大小所估計的基因數(shù)微生物基因組DNA絕大部分用來編碼蛋白質(zhì)、RNA；用作為復(fù)制起點、啟動子、終止子和一些由調(diào)節(jié)蛋白識別和結(jié)合的位點等信號序列。一般不含內(nèi)含子，遺傳信息是連續(xù)的而不是中斷的。真核生物基因組的一個重要特點就是含有內(nèi)含子個別細菌(鼠傷寒沙門氏菌和犬螺桿菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子或間插序列第八章微生物遺傳與育種1、原核生物（細菌、古生菌）的基因組a）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；b）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性；c）功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu)；d）結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝；e）基因組的重復(fù)序列少而短；操縱子（operon）：功能相關(guān)的幾個基因前后相連，再加上一個共同的調(diào)節(jié)基因和一組共同的控制位點（啟動子、操作子等）在基因轉(zhuǎn)錄時協(xié)同動作。第八章微生物遺傳與育種2真核微生物（啤酒酵母）的基因組a）典型的真核染色體結(jié)構(gòu)；b）沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)；啤酒酵母基因組大小為13.5×106bp，分布在16條染色體中。c）有間隔區(qū)（即非編碼區(qū)）和內(nèi)含子序列；d）重復(fù)序列多；第八章微生物遺傳與育種三、質(zhì)粒（plasmid）：一種獨立于染色體外，能進行自主復(fù)制的細胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細胞中。轉(zhuǎn)座因子（transposableelement）：位于染色體或質(zhì)粒上的一段能改變自身位置的DNA序列，廣泛分布于原核和真核細胞中。質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子是細胞中除染色體以外的另外二類遺傳因子第八章微生物遺傳與育種1、質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)通常以共價閉合環(huán)狀(covalentlyclosedcircle，簡稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細胞中；也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒；質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb；（細菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi)）第八章微生物遺傳與育種高拷貝數(shù)(highcopynumber)質(zhì)粒（每個宿主細胞中可以有10-100個拷貝）———————松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)低拷貝數(shù)(lowcopynumber)質(zhì)粒（每個宿主細胞中可以有1-4個拷貝）———————嚴緊型質(zhì)粒(stringentplasmid)窄宿主范圍質(zhì)粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一種特定的宿主細胞中復(fù)制）廣宿主范圍質(zhì)粒(broadhostrangeplasmid)（可以在許多種細菌中復(fù)制）第八章微生物遺傳與育種在某些特殊條件下，質(zhì)粒有時能賦予宿主細胞以特殊的機能，從而使宿主得到生長優(yōu)勢。質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷毎话闶欠潜匦璧?；第八章微生物遺傳與育種2、質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用質(zhì)粒的優(yōu)點：（1）體積小，易分離和操作（2）環(huán)狀，穩(wěn)定（3）獨立復(fù)制（4）拷貝數(shù)多（5）存在抗藥性基因等標記位點，易篩選E.coli的pBR322質(zhì)粒是一個常用的克隆載體第八章微生物遺傳與育種3、質(zhì)粒的檢測提取所有胞內(nèi)DNA后電鏡觀察；超速離心或瓊脂糖凝膠電泳后觀察；對于實驗室常用菌，可用質(zhì)粒所帶的某些特點，如抗藥性初步判斷。第八章微生物遺傳與育種4、質(zhì)粒的主要類型質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)致育因子（Fertilityfactor，F(xiàn)因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子）產(chǎn)細菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性質(zhì)粒（virulenceplasmid）代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）隱秘質(zhì)粒（crypticplasmid）第八章微生物遺傳與育種(1)致育因子(Fertilityfactor，F(xiàn)因子)又稱F質(zhì)粒，其大小約100kb，這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象（接合作用）有關(guān)的質(zhì)粒。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株（相當于雄性），無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株（相當于雌性）。F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細胞中，所以又稱之為附加體(episome)。第八章微生物遺傳與育種第三節(jié)質(zhì)粒(2)抗性因子（Resistancefactor，R因子）包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡稱R質(zhì)粒。R100質(zhì)粒(89kb)可使宿主對下列藥物及重金屬具有抗性：汞（mercuricion，mer）四環(huán)素（tetracycline，tet）鏈霉素(Streptomycin,Str)、磺胺(Sulfonamide,Su)、氯霉素(Chlorampenicol,Cm)夫西地酸（fusidicacid，fus）并且負責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上。抗性質(zhì)粒在細菌間的傳遞是細菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。第八章微生物遺傳與育種(3)產(chǎn)細菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）細菌素結(jié)構(gòu)基因、涉及細菌素運輸及發(fā)揮作用（processing）的蛋白質(zhì)的基因、賦予宿主對該細菌素具有“免疫力”的相關(guān)產(chǎn)物的基因一般都位于質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上，因此，細菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。第八章微生物遺傳與育種(3)產(chǎn)細菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）細菌素一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進行命名：大腸桿菌（E.coli）產(chǎn)生的細菌素為colicins（大腸桿菌素），而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒。由G+細菌產(chǎn)生的細菌素或與細菌素類似的因子與colicins有所不同，但通常也是由質(zhì)粒基因編碼，有些甚至有商業(yè)價值，例如一種乳酸細菌產(chǎn)生的細菌素NisinA能強烈抑制某些G+細菌的生長，而被用于食品工業(yè)的保藏。第八章微生物遺傳與育種(4)毒性質(zhì)粒（virulenceplasmid）許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因，其產(chǎn)物對宿主（動物、植物）造成傷害。產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動物腹瀉的主要病原菌之一，其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒。蘇云金桿菌含有編碼δ內(nèi)毒素(伴孢晶體中)的質(zhì)粒根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子第八章微生物遺傳與育種(5)代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基質(zhì)的酶，進行共生固氮，或產(chǎn)生抗生素（某些放線菌）等。將復(fù)雜的有機化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式，環(huán)境保護方面具有重要的意義。假單胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、農(nóng)藥(2,4dichlorophenoxyaceticacid)、辛烷和樟腦等的能力。降解質(zhì)粒：第八章微生物遺傳與育種(6)隱秘質(zhì)粒（crypticplasmid）隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng)，它們的存在只有通過物理的方法，例如用凝膠電泳檢測細胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。它們存在的生物學(xué)意義，目前幾乎不了解。在應(yīng)用上，很多隱秘質(zhì)粒被加以改造作為基因工程的載體（一般加上抗性基因）第八章微生物遺傳與育種5、質(zhì)粒的不親和性質(zhì)粒之間的不親和性、以及質(zhì)?？截悢?shù)的多少、能適應(yīng)的宿主范圍的寬窄等特性均與質(zhì)粒的復(fù)制控制類型有關(guān)，欲了解詳細內(nèi)容請選修“微生物遺傳學(xué)”。第八章微生物遺傳與育種第三節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變

一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變、可遺傳、自發(fā)或誘變產(chǎn)生基因突變狹義：點突變廣義：基因突變和染色體畸變野生型（原始性狀）基因突變突變型（新性狀）第八章微生物遺傳與育種（一）突變的類型從突變的效應(yīng)看同義突變錯義突變無義突變從突變的表型看第八章微生物遺傳與育種1）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）一種缺乏合成其生存所必須的營養(yǎng)物（包括氨基酸、維生素、堿基等）的突變型，只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)或其前體物（precursor）才能生長。營養(yǎng)缺陷型是微生物遺傳學(xué)研究中重要的選擇標記和育種的重要手段表型判斷的標準：在基本培養(yǎng)基上能否生長第八章微生物遺傳與育種1）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）特點：在選擇培養(yǎng)基（一般為基本培養(yǎng)基）上不生長負選擇標記突變株不能通過選擇平板直接獲得第八章微生物遺傳與育種Positiveselection正選擇標記In

positiveselection,onlythosemutantcellsthatcansurviveinamediumcontainingaselectiveagentsuchaspenicillincansurvive.

第八章微生物遺傳與育種

negativeselection負選擇標記In

negativeselection,

nutritionalmutantscalled

auxotrophs

cannotgrowona

minimalmediumlackingakeynutrient.

Themutantsareidentifiedbythe

replicateorganismdirectagarcontact(RODAC)technique.

第八章微生物遺傳與育種影印平板（Replicaplating）法是Lederberg夫婦在1952年建立1）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）第八章微生物遺傳與育種營養(yǎng)缺陷型的表示方法：1）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）基因型：所需營養(yǎng)物的前三個英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個字母大寫，且不用斜體：HisC在具體使用時多用hisC-和hisC+，分別表示缺陷型和野生型。第八章微生物遺傳與育種2）抗藥性突變型（resistantmutant）基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性。特點：正選擇標記（突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）表示方法：所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”表示strr和strs分別表示對鏈霉素的抗性和敏感性第八章微生物遺傳與育種3）條件致死突變型（conditionallethalmutant）在某一條件下具有致死效應(yīng)，而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變型。常用的條件致死突變是溫度敏感突變，用ts（temperaturesensitive）表示，這類突變在高溫下（如42℃）是致死的，但可以在低溫（如25-30℃）下得到這種突變。特點：負選擇標記這類突變型常被用來分離生長繁殖必需的突變基因第八章微生物遺傳與育種4）形態(tài)突變型（morphologicalmutant）造成形態(tài)改變的突變型特點：非選擇性突變突變株和野生型菌株均可生長，但可從形態(tài)特征上進行區(qū)分。舉例：產(chǎn)蛋白酶缺陷突變株的篩選菌落顏色變化β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重組子菌落為白色而與蘭色的非重組子分開。形成芽孢缺陷菌株細胞水平上的形態(tài)突變，突變株的檢出更加困難。第八章微生物遺傳與育種5）其它突變類型毒力、生產(chǎn)某種代謝產(chǎn)物的發(fā)酵能力的變化等在實際應(yīng)用中具有重要意義突變類型一般都不具有很明顯或可直接檢測到的表型。其突變株的獲得往往需要較大的工作量。第八章微生物遺傳與育種1、特點1）自發(fā)性2）非對應(yīng)性3）稀有性4）穩(wěn)定性5）獨立性6）可誘變性7）可逆性（二）基因突變的特點第八章微生物遺傳與育種證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應(yīng)關(guān)系！如何證明基因突變的非對應(yīng)性？三個經(jīng)典實驗變量實驗、涂布實驗、影印實驗2、實驗證據(jù)第八章微生物遺傳與育種變量實驗（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種Newcombe的涂布實驗（1949）第八章微生物遺傳與育種影印實驗（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958第八章微生物遺傳與育種點突變（pointmutaion）染色體畸變(chromosomalaberration)（三）基因突變及其機制第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種1、誘發(fā)突變：物理、化學(xué)核生物的因素，提高突變率的人為的作法（1）堿基的置換第八章微生物遺傳與育種同義突變：有時DNA的一個堿基對的改變并不會影響它所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，這是因為改變后的密碼子和改變前的密碼子是簡并密碼子，它們編碼同一種氨基酸，這種基因突變稱為同義突變堿基的置換引起的突變第八章微生物遺傳與育種錯義突變由于一對或幾對堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變?yōu)闆Q定另一種氨基酸的密碼子的基因突變叫錯義突變。第八章微生物遺傳與育種無義突變被改變的密碼子為終止符號，它不能編碼任何一種氨基酸，是蛋白質(zhì)合成提前終止，因此為無義突變第八章微生物遺傳與育種ChemicalAgentsthatModifyDNAEffectsofNitrousAcid

第八章微生物遺傳與育種Base-AnalogMutagens5-Bromo-uracilcansubstituteforT,andthenwindupbindingwithG(ratherthanA),thusinducingaTRANSITION(G->A)mutation.第八章微生物遺傳與育種（2）移碼突變：添加或缺失核苷酸，引起閱讀錯誤錯誤+錯誤-+正常---正常+++正常第八章微生物遺傳與育種（3）染色體畸變：缺失、重復(fù)、插入、易位、倒位第八章微生物遺傳與育種ChromosomaldeletionAdeletionoccurswhenachromosomebreaksandsomegeneticmaterialislost.第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種ChromosomalduplicationAduplicationoccurswhenpartofachromosomeiscopied(duplicated)abnormally,resultinginextrageneticmaterialfromtheduplicatedsegment.第八章微生物遺傳與育種BalancedtranslocationInabalancedtranslocation,piecesofchromosomesarerearrangedbutnogeneticmaterialisgainedorlostinthecell.

第八章微生物遺傳與育種UnbalancedtranslocationAnunbalancedtranslocationoccurswhenachildinheritsachromosomewithextraormissinggeneticmaterialfromaparentwithabalancedtranslocation.第八章微生物遺傳與育種InversionInversionsoccurwhenachromosomebreaksintwoplacesandtheresultingpieceofDNAisreversedandre-insertedintothechromosome.Inversionsthatinvolvethecentromerearecalledpericentricinversions;thosethatdonotinvolvethecentromerearecalledparacentricinversions.第八章微生物遺傳與育種DicentricchromosomeDicentricchromosomesresultfromtheabnormalfusionoftwochromosomepieces,eachofwhichincludesacentromere.第八章微生物遺傳與育種RingchromosomeRingchromosomesusuallyoccurwhenachromosomebreaksintwoplacesandtheendsofthechromosomearmsfusetogethertoformacircularstructure.第八章微生物遺傳與育種IsochromosomesAnisochromosomeisanabnormalchromosomewithtwoidenticalarms,eithertwoshort(p)armsortwolong(q)arms.第八章微生物遺傳與育種2、自發(fā)突變：無人為因素下的低頻率突變原因：（1）背景輻射（2）有害產(chǎn)物積累（3）堿基錯配第八章微生物遺傳與育種六）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)紫外線的作用機制:1、紫外線可引起DNA鏈斷裂2、可引起嘧啶發(fā)生水合作用，造成氫鏈的斷裂。3、可引起DNA分子內(nèi)或分子間交聯(lián)4、引起胸腺嘧啶（T）之間形成二聚體(TT)，這是引起突變最主要的原因。第八章微生物遺傳與育種（六）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶嘧啶二聚體UV第八章微生物遺傳與育種1、光復(fù)活作用嘧啶二聚體嘧啶光解酶第八章微生物遺傳與育種2、切除修復(fù)第八章微生物遺傳與育種二、突變與育種（一）自發(fā)突變與育種：選育定向培育（二）誘變育種1、誘變育種的基本環(huán)節(jié)第八章微生物遺傳與育種誘變育種的步驟

出發(fā)菌株

培養(yǎng)液

單個細胞或孢子懸液

誘變劑處理

平板分離純化，同步培養(yǎng)離心收集細胞、洗滌，制菌懸液，玻璃珠打散，過濾活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗存活細胞計數(shù)，計算致死率變異率計算

性能粗測性能精測挑變異菌于斜面培養(yǎng)基上初篩

復(fù)篩菌種保藏及擴大試驗菌種用于生產(chǎn)，并進行保藏第八章微生物遺傳與育種2．誘變育種工作中應(yīng)考慮的幾個原則

（1）選擇簡便有效的誘變劑（2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（3）處理單孢子（或單細胞）懸液（4）選用最適劑量（5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標（7）設(shè)計高效篩選方案（8）創(chuàng)造新型篩選方法第八章微生物遺傳與育種

誘變育種中的幾個注意事項1.出發(fā)菌株的選擇：選擇合適的出發(fā)菌株相當重要出發(fā)菌株———用來育種處理的起始菌株出發(fā)菌株應(yīng)具備對誘變劑的敏感性高；具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；出發(fā)菌株的來源自然界直接分離到的野生型菌株歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的菌株已經(jīng)歷多次育種處理的菌株

第八章微生物遺傳與育種2.單孢子懸液在誘變育種中，所處理的細胞必須是單細胞、均勻的懸液狀態(tài)。分散狀態(tài)的細胞可以均勻地接觸誘變劑，要求：菌體處于對數(shù)生長期，并使細胞處于同步生細胞分散且為單細胞，以避免表型遲延現(xiàn)象方法：玻璃珠打散10-15min;加０.3%吐溫80（表面活性劑）用無菌脫脂棉過濾。

第八章微生物遺傳與育種3.誘變劑的選擇選擇簡便有效的誘變劑。物理誘變劑：X射線、γ射線、快中子、紫外線、α-射線、β-射線和超聲波；化學(xué)誘變劑：種類較多，根據(jù)作用機制分3類：與一個或多個核酸堿基起化學(xué)變化，引起DNA復(fù)制時堿基配對的轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異如亞硝酸、硫酸二乙酯等；與DNA中堿基十分接近的類似物，摻入到DNA分子中而引起變異。如5-溴尿嘧啶；在DNA上減少或增加一、二個堿基，引起堿基突變點后全部密碼轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯的錯誤，如吖啶類物質(zhì)；第八章微生物遺傳與育種常用的物理和化學(xué)誘變劑紫外線15W紫外燈、照射距離30cm，無可見光的接種室或箱體中（只有紅光），照射時間10-20秒～10-20min，小培養(yǎng)皿亞硝基胍－超誘變劑涂布平板上添加誘變劑顆?；蚪姓T變劑溶液的濾紙片第八章微生物遺傳與育種誘變劑的作用：提高突變的頻率擴大產(chǎn)量變異的幅度使產(chǎn)量變異朝著正突變或負突變移動最適劑量的選擇：產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在70~80%）第八章微生物遺傳與育種

4.選擇合適的誘變劑量由于誘變劑常常是用來提高突變率，突變率往往隨劑量的增高而提高，正突變較多出現(xiàn)在偏低的劑量中，負突變則較多出現(xiàn)在偏高的劑量中，所以要選擇最適的劑量在育種工作中，常采用殺菌率表示殺菌的劑量。殺菌率的計算是取同樣量的被處理菌體和未被處理的菌體分別在完全培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，檢測各自的生長的菌落：第八章微生物遺傳與育種

劑量的表示法：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。不同誘變劑劑量的表達方式不同致死率是最好的誘變劑相對劑量的表示方法UV劑量=強度×作用時間化學(xué)殺菌劑的劑量：在一定的外界條件下，誘變劑的濃度與作用時間常用殺菌率作各種誘變劑的相對劑量第八章微生物遺傳與育種誘變過程中的兩條重要曲線劑量存活率曲線

以誘變劑的劑量為橫坐標、以細胞存活數(shù)的對數(shù)值為縱坐標繪制的曲線劑量誘變率曲線

以誘變劑的劑量為橫坐標，以誘變后獲得的突變細胞數(shù)為縱坐標繪制的曲線第八章微生物遺傳與育種艾姆斯試驗（Amestest）利用細菌營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變檢出環(huán)境或食品中是否存在化學(xué)致癌劑的一種簡便有效方法Strainusedinamestest：DNA修復(fù)酶缺陷型Salmonellatyphimurium

his－E.colitry－λ噬菌體的誘導(dǎo)作用原理

his-在基本培養(yǎng)基上不長；而發(fā)生回復(fù)突變則長應(yīng)用

檢測食品、飲料、藥物和飲水和環(huán)境中的致癌物質(zhì)

快速、準確、費用低第八章微生物遺傳與育種艾姆斯試驗方法示意圖第八章微生物遺傳與育種Reversionmutations

intheAmesTest

Thedishontheleftwasplatedwithabout109

his-

bacteria.Inthiscontrolexperiment,intheabsenceofaddedhistidine,suchbacteriawillnotgrow,exceptforasmallnumber(<102)ofwhitecoloniesderviedfromsinglebacteriathathaveundergone

spontaneousreversionmutations

to

his+.Intheexperimentontheright,thediscinthemiddleofthedishcontainsamutagenicchemical.第八章微生物遺傳與育種菌種篩選篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進行。初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡單。復(fù)篩的目的：確認符合要求的菌株；復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標。第八章微生物遺傳與育種新型篩選方法產(chǎn)量突變株：初篩：搖瓶、平板（快速、簡便、直觀）平皿快速檢測法變色圈法透明圈法生長圈法抑菌圈法梯度平板法復(fù)篩：對產(chǎn)量突變株作生產(chǎn)性能的精確測定搖瓶、臺式自動發(fā)酵罐第八章微生物遺傳與育種3．3類突變株的篩選方法1）產(chǎn)量突變株的篩選2）抗藥性突變株的篩選3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選第八章微生物遺傳與育種

1)產(chǎn)量突變株的篩選春日霉素生產(chǎn)菌的篩選——瓊脂塊培養(yǎng)法第八章微生物遺傳與育種2)抗藥性突變株的篩選用梯度平板法篩選抗代謝拮抗物突變株作為生產(chǎn)菌種（結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株）作為菌株的遺傳標記第八章微生物遺傳與育種3)營養(yǎng)缺陷型突變株(auxotroph)的篩選

相關(guān)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基[-]完全培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基三類遺傳型野生型[A+B+]營養(yǎng)缺陷型型[A+B-]原養(yǎng)型[A+B+][+][A]或[B]第八章微生物遺傳與育種與突變株的篩選相關(guān)的幾個概念野生型：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株。lys+;bio+

可在MM上生長，如：[A+B+]營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)誘變處理后，由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長。

lys-

，bio-只能在CM或相應(yīng)的SM上生長。如：[A+B-]

原養(yǎng)型：指營養(yǎng)缺陷型突變菌株經(jīng)回復(fù)或重組后產(chǎn)生的菌株。其營養(yǎng)要求在表現(xiàn)型上與野生型相同第八章微生物遺傳與育種

2.與篩選有關(guān)的三種培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基（MM）：僅能滿足某種微生物的野生型菌株生長需要的最低成分組合培養(yǎng)基

用[-]表示。②完全培養(yǎng)基（CM）：凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。用[+]表示。③補充培養(yǎng)基（SM）：凡可滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株生長需要的組合培養(yǎng)基。在MM上添加有某一微生物營養(yǎng)缺陷型所不能合成的代謝物即構(gòu)成SM，用[A]或[B]表示。補充培養(yǎng)基=基本培養(yǎng)基+缺陷的代謝物

第八章微生物遺傳與育種3.營養(yǎng)缺陷型的篩選步驟營養(yǎng)缺陷型的鑒定

誘變處理營養(yǎng)缺陷型的濃縮營養(yǎng)缺陷型的檢出第八章微生物遺傳與育種營養(yǎng)缺陷型的篩選步驟1.誘變劑的處理（略）2.淘汰野生型：（又稱濃縮）a.抗生素法：青霉素法；適合于細菌；制霉菌素法，適用于真菌。原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細胞，對休止態(tài)細胞無作用。方法：將菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基中第八章微生物遺傳與育種b.菌絲過濾法：適用于絲狀生長的真菌或放線菌原理：基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲；auxo孢子可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。第八章微生物遺傳與育種3.營養(yǎng)缺陷型的檢出同一培養(yǎng)皿上有夾層培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法不同的培養(yǎng)皿上有逐個檢出法影印接種法第八章微生物遺傳與育種

影印培養(yǎng)法完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基abc第八章微生物遺傳與育種

基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基夾層培養(yǎng)法及其結(jié)果中間一層含菌第八章微生物遺傳與育種4.鑒定缺陷型生長譜法（Auxanography）

在混有供試菌的平板表面點加微量營養(yǎng)物，視某營養(yǎng)物的周圍是否長菌來確定該供試菌的營養(yǎng)要求的一種快速直觀的方法。操作過程營養(yǎng)缺陷型細胞培養(yǎng)制備菌種懸液平板傾注，區(qū)域劃分添加營養(yǎng)物質(zhì)粉末培養(yǎng)觀察類似方法可以測定雙重或多重營養(yǎng)缺陷型第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種5.缺陷型的應(yīng)用作為菌株的遺傳標記：進行基因工程、誘變育種研究代謝過程時用作親本標記；作為生產(chǎn)菌種：氨基酸、核苷酸等生產(chǎn)菌種；作為氨基酸、維生素、堿基的測定菌株第八章微生物遺傳與育種基因重組:兩個獨立基因組內(nèi)的遺傳基因,通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起,形成新的穩(wěn)定基因組的過程,稱為基因重組.雜交:指在細胞水平上進行的一種遺傳重組方式.第四節(jié)基因重組和雜交育種第八章微生物遺傳與育種細菌的三種水平基因轉(zhuǎn)移形式接合轉(zhuǎn)導(dǎo)自然轉(zhuǎn)化第八章微生物遺傳與育種原核微生物基因重組的特點1、片段性，僅一小段DNA參與重組2、單向性，即從供體菌向受體菌作單方向轉(zhuǎn)移3、轉(zhuǎn)移機制獨特而多樣第八章微生物遺傳與育種接合(conjugation)：細胞與細胞的直接接觸（由F因子介導(dǎo)）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌體介導(dǎo)自然遺傳轉(zhuǎn)化(naturalgenetictransformation)：游離DNA分子+感受態(tài)細胞第八章微生物遺傳與育種一、細菌的接合作用(conjugation)通過細胞與細胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程1.實驗證據(jù)

1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Tatum細菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗第八章微生物遺傳與育種中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！第八章微生物遺傳與育種證實接合過程需要細胞間的直接接觸的“U”型管實驗（BernardDavis，1950）第八章微生物遺傳與育種BernardDavisUtubeexpreiment，1950第八章微生物遺傳與育種2.機制(大腸桿菌的接合機制)接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo)F因子的分子量通常為5×107，上面有編碼細菌產(chǎn)生性菌毛（sexpili）及控制接合過程進行的20多個基因。含有F因子的細胞：“雄性”菌株（F+），其細胞表面有性菌毛不含F(xiàn)因子的細胞：“雌性”菌株（F-），細胞表面沒有性菌毛第八章微生物遺傳與育種F因子為附加體質(zhì)粒既可以脫離染色體在細胞內(nèi)獨立存在，也可插入（整合）到染色體上第八章微生物遺傳與育種F因子的四種細胞形式a）F-菌株，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收

F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F(xiàn)因子獨立存在，細胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細胞表面同樣有性菌毛。第八章微生物遺傳與育種1）F+×F-雜交雜交的結(jié)果：給體細胞和受體細胞均成為F+細胞理化因子的處理可將F因子消除而使F+菌株變成F-菌株F+菌株的F因子向F-細胞轉(zhuǎn)移，但含F(xiàn)因子的宿主細胞的染色體DNA一般不被轉(zhuǎn)移。第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移過程，就可以把部分甚至全部細菌染色體傳遞給F-細胞并發(fā)生重組，由此而得名為高頻重組菌株。2）Hfr×F-雜交Hfr菌株仍然保持著F+細胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F-細胞進行接合。所不同的是，當OriT序列被缺刻螺旋酶識別而產(chǎn)生缺口后，F(xiàn)因子的先導(dǎo)區(qū)(leadingregion)結(jié)合著染色體DNA向受體細胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)因子除先導(dǎo)區(qū)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細胞(或接合子)大多數(shù)仍然是F-。第八章微生物遺傳與育種染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進入的機會就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時間就越早，頻率也高。F因子不易轉(zhuǎn)入受體細胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細胞（或稱接合子）大多數(shù)仍然是F-。第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種3）F′×F-雜交Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。F′×F-與F+×F-的不同：給體的部分染色體基因隨F′一起轉(zhuǎn)入受體細胞a）與染色體發(fā)生重組；b）繼續(xù)存在于F′因子上，形成一種部分二倍體；細胞基因的這種轉(zhuǎn)移過程又常稱為性導(dǎo)（sexduction）、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-duction），或F因子媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-mediatedtransduction）。第八章微生物遺傳與育種二、細菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）由噬菌體介導(dǎo)的細菌細胞間進行遺傳交換的一種方式：一個細胞的DNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個細胞中能將一個細菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個細菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體細菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)第八章微生物遺傳與育種1、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)給體染色體的任何部分到受體細胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程(1)意外的發(fā)現(xiàn)1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder為了證實大腸桿菌以外的其它菌種是否也存在接合作用，用二株具不同的多重營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌進行類似的實驗：用“U”型管進行同樣的實驗時，在給體和受體細胞不接觸的情況下，同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細菌！第八章微生物遺傳與育種沙門氏菌LT22A是攜帶P22噬菌體的溶源性細菌另一株是非溶源性細菌一個表面看起來的常規(guī)研究卻導(dǎo)致一個驚奇和十分重要發(fā)現(xiàn)的重要例證！基因的傳遞很可能是由可透過“U”型管濾板的P22噬菌體介導(dǎo)的（普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)這一重要的基因轉(zhuǎn)移途徑的發(fā)現(xiàn)）第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種轉(zhuǎn)導(dǎo)模型第八章微生物遺傳與育種(2)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)第八章微生物遺傳與育種轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體為什么“錯”將宿主的DNA包裹進去?噬菌體的DNA包裝酶酶也能識別染色體DNA上類似pac的位點并進行切割，以“headful”的包裝機制包裝進P22噬菌體外殼，形成只含宿主DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒（假噬菌體）。因為染色體上的pac與P22DNA的pac序列不完全相同，利用效率較低，這種“錯裝”機率一般僅約10-6-10-8第八章微生物遺傳與育種形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒的噬菌體可以是溫和的也可以是烈性的，但必須具有能偶爾識別宿主DNA的包裝機制并在宿主基因組完全降解以前進行包裝。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本要求：第八章微生物遺傳與育種普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果：進入受體的外源DNA通過與細胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）第八章微生物遺傳與育種DNA不能復(fù)制，因此群體中僅一個細胞含有DNA，而其它細胞只能得到其基因產(chǎn)物，形成微小菌落。轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進行重組和復(fù)制，但其攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達。特點：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）第八章微生物遺傳與育種2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction）溫和噬菌體感染整合到細菌染色體的特定位點上宿主細胞發(fā)生溶源化溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時，在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中第八章微生物遺傳與育種2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction）溫和噬菌體λ裂解時的不正常切割：包含gal或bio基因（幾率一般僅有10-6）第八章微生物遺傳與育種局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別：a）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價地與噬菌體DNA連接，與噬菌體DNA一起進行復(fù)制、包裝以及被導(dǎo)入受體細胞中。而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝的可能全部是宿主菌的基因。b）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個別基因?qū)胧荏w，故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的宿主基因具有隨機性。2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction）第八章微生物遺傳與育種

溶源轉(zhuǎn)變（lysogenicconversion）：一個與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象溫和噬菌體感染細胞后使之發(fā)生溶源化，因噬菌體的基因整合到宿主染色體上，而使后者獲得了新性狀的現(xiàn)象。溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同？a）不攜帶任何供體菌的基因；b）這種噬菌體是完整的，而不是缺陷的；第八章微生物遺傳與育種三、細菌的遺傳轉(zhuǎn)化（genetictransformation）定義：同源或異源的游離DNA分子(質(zhì)粒和染色體DNA)被自然或人工感受態(tài)細胞攝取，并得到表達的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過程自然遺傳轉(zhuǎn)化（naturalgenetictransformation）人工轉(zhuǎn)化（artificialtransformation）感受態(tài)細胞：具有攝取外源DNA能力的細胞（competentcell）第八章微生物遺傳與育種自然感受態(tài)與人工感受態(tài)的不同？自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細胞一定生長階段的生理特性，受細菌自身的基因控制；人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細胞內(nèi)。

（該過程與細菌自身的遺傳控制無關(guān)！）第八章微生物遺傳與育種1、自然遺傳轉(zhuǎn)化（簡稱自然轉(zhuǎn)化）1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）

的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象目前已知有二十多個種的細菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力進行自然轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：建立了感受態(tài)的受體細胞外源游離DNA分子第八章微生物遺傳與育種枯草芽孢桿菌的自然轉(zhuǎn)化過程（革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化模型）第八章微生物遺傳與育種Themechanismofbacterialtransformation第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種自然轉(zhuǎn)化過程的特點：a）對核酸酶敏感；c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNA）

給體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系；d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多；b）不需要活的DNA給體細胞；第八章微生物遺傳與育種噬菌體DNA被感受態(tài)細胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒轉(zhuǎn)染(transfection)：現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細胞的過程也稱轉(zhuǎn)染提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進入細胞并表達后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。特點：第八章微生物遺傳與育種ConjugationTransformationTransduction第八章微生物遺傳與育種接合(conjugation)：細胞與細胞的直接接觸（由F因子介導(dǎo)）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌體介導(dǎo)自然遺傳轉(zhuǎn)化(naturalgenetictransformation)：游離DNA分子+感受態(tài)細胞第八章微生物遺傳與育種“接合”“轉(zhuǎn)導(dǎo)”及“自然轉(zhuǎn)化”這三種在自然界中存在的細菌遺傳重組過程各自的特點：a）外源DNA的來源及進入途徑有差異；b）決定因素也各有不同；如何設(shè)計實驗對三種途徑進行區(qū)分？第八章微生物遺傳與育種2、人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項細菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。不是由細菌自身的基因所控制；用多種不同的技術(shù)處理受體細胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高；第八章微生物遺傳與育種四、原生質(zhì)體融合第八章微生物遺傳與育種原生質(zhì)體融合

定義：通過人為的方式，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并進而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的遺傳性穩(wěn)定的融合子的過程。原生質(zhì)體與上述各種雜交方式的比較：1.雜交頻率高2.致育型的限制較少3.遺傳物質(zhì)的傳遞更完整原生質(zhì)體融合的對象；能進行原生質(zhì)體融合的細胞有：細菌、放線菌，及各種真核細胞，如霉菌、酵母菌以及高等動植物的細胞。第八章微生物遺傳與育種原生質(zhì)體的融合步驟如下1.原生質(zhì)體的制備：作為制備原生質(zhì)體的親本菌株必須具備兩個特點：a.具有良好的生產(chǎn)性狀，以經(jīng)融合使優(yōu)點疊加；b.具有一些穩(wěn)定的明顯的遺傳標記制備原生質(zhì)體時所選用的菌體一般為對數(shù)后期的微生物，不同微生物破壁所用的酶的種類、濃度以及破壁時處理的溫度、時間、PH均不同。2.原生質(zhì)體融合僅用等量的原生質(zhì)體混合時，融合的頻率很低，加入PEG及Ca2+、Mg2+，可使原生質(zhì)表面形成電極性，相互吸引，形成聚合物。3.再生成正常細胞4.鑒定第八章微生物遺傳與育種二、真核微生物的基因重組真核微生物的基因重組主要有有性雜交、準性雜交、原生質(zhì)體融合和轉(zhuǎn)化等形式。（一）有性雜交nn2n減數(shù)分裂nn+n第八章微生物遺傳與育種

（二）準性生殖

定義：是一種類似于有性生殖，但比其更原始的生殖方式，可使同種生物兩種不同菌株的體細胞發(fā)生融合，且不以減數(shù)分裂的方式而導(dǎo)致的低頻率的基因重組。霉菌的準性生殖包括：1.異核體的形成2.雜合二倍體的形成3.分離第八章微生物遺傳與育種

準性生殖的育種步驟第八章微生物遺傳與育種第四節(jié)基因工程特點：可設(shè)計性、穩(wěn)定性、遠緣性、風(fēng)險性一、基因工程定義：在基因水平上，改造遺傳物質(zhì)，從而使物種發(fā)生變異，創(chuàng)建出具有某種穩(wěn)定新性狀的生物新品系。第八章微生物遺傳與育種獲得目的基因選擇基因載體體外重組外源基因?qū)耄毦?、植物、動物、基因槍）篩選和鑒定應(yīng)用二、基因工程的基本操作第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種第五節(jié)菌種保藏性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進行。影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：a）變異；b）污染；c）死亡；第八章微生物遺傳與育種一、菌種的衰退與復(fù)壯1）從衰退的菌種群體中把少數(shù)個體再找出來，重新獲得具有原有典型性狀的菌種。2）有意識地利用微生物會發(fā)生自發(fā)突變的特性，在日常的菌種維護工作中不斷篩選“正變”個體。大量群體中的自發(fā)突變菌種的復(fù)壯：a）純種分離；b）通過寄主體進行復(fù)壯；菌種衰退的特點：第八章微生物遺傳與育種二、防止衰退的措施1）減少傳代次數(shù)；2）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件；3）經(jīng)常進行純種分離，并對相應(yīng)的性狀指標進行檢查；4）采用有效的菌種保藏方法；第八章微生物遺傳與育種三、菌種保藏在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：基本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空干燥第八章微生物遺傳與育種三、菌種保藏迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物均適宜。菌株的特性保藏物的使用特點現(xiàn)有條件等進行綜合考慮第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種國際重要菌種保藏機構(gòu)第八章微生物遺傳與育種中國菌種保藏單位第八章微生物遺傳與育種本章小結(jié)經(jīng)典實驗質(zhì)粒突變誘變育種原則營養(yǎng)缺陷型兩種生物基因重組基因工程衰退與復(fù)壯第八章微生物遺傳與育種思考題：1、如果二個不同營養(yǎng)缺陷標記（a-b-c+d+和a+b+c-d-）的菌株經(jīng)混合后能產(chǎn)生在基本培養(yǎng)基平板上生長的原養(yǎng)型重組菌株，請設(shè)計一個實驗來決定該遺傳轉(zhuǎn)移過程是轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)還是接合?2、自然遺傳轉(zhuǎn)化與人工轉(zhuǎn)化之間有什么關(guān)系?為什么在一般情況下它們轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的成功率有如此大的差別?第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種（1）使用簡便有效的誘變劑誘變劑物理因素化學(xué)因素紫外線激光離子束X射線r射線快中子烷化劑堿基類似物吖啶化合物第八章微生物遺傳與育種誘變劑與致癌物質(zhì)——Ames試驗a）利用各種誘變劑獲得各類遺傳突變，進行誘變育種；c）危害人類自身的健康b）對有害微生物進行控制；很多種化學(xué)物質(zhì)，能以各種機制導(dǎo)致DNA的突變第八章微生物遺傳與育種美國加利福尼亞大學(xué)的BruceAmes教授于1966年發(fā)明，因此稱為Ames試驗利用細菌營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變來檢測環(huán)境或食品中是否存在化學(xué)致癌劑的簡便有效方法.Ames試驗第八章微生物遺傳與育種“生物化學(xué)統(tǒng)一性”法則：人和細菌在DNA的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。第八章微生物遺傳與育種誘變劑的共性原則：化學(xué)藥劑對細菌的誘變率與其對動物的致癌性成正比

超過95%的致癌物質(zhì)對微生物有誘變作用90%以上的非致癌物質(zhì)對微生物沒有誘變作用第八章微生物遺傳與育種回復(fù)突變(reversemutation或backmutation)：突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到恢復(fù)，這種第二次突變稱為回復(fù)突變Ames試驗具體操作：檢測鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphmurium)組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復(fù)突變率培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基第八章微生物遺傳與育種Ames試驗第八章微生物遺傳與育種證明Ames試驗重要性的應(yīng)用實例：國外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)停”，由于其藥效顯著，在60-70年代十分流行，但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應(yīng)停”，后來采用Ames試驗發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進行Ames試驗檢測，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免，第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種挑選優(yōu)良菌株①最好選用來自生產(chǎn)中的自發(fā)突變菌株②選用具有有利于進一步研究或應(yīng)用性狀的菌株③可選用已發(fā)生過其它突變的菌株④選用對誘變劑敏感性較高的增變變異株第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種篩選方案第三輪、第四輪……（都同第二輪）第一輪第二輪第八章微生物遺傳與育種營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選第八章微生物遺傳與育種營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法誘變檢出營養(yǎng)缺陷型淘汰野生型鑒定營養(yǎng)缺陷型富集培養(yǎng)（抗生素法）（菌絲過濾法）夾層培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法逐個檢出法影印平板法生長譜法第八章微生物遺傳與育種第八章微生物遺傳與育種Thereare(atleast)5differentwaysof

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