DNA的復(fù)制、修復(fù)與重組DNA技術(shù)第十二章DNAreplication,repairandbination2

引言以中心法則為基本線索，現(xiàn)代分子生物學(xué)的基本內(nèi)容包括：復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、基因表達(dá)調(diào)控和重組DNA技術(shù)3遺傳信息如何傳遞？DNA復(fù)制（replication）42.遺傳信息如何表達(dá)？轉(zhuǎn)錄(Transcription)

DNA的堿基按互補(bǔ)配對(duì)(G-C,T-A,A-U)的原則轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA(B)翻譯(Translation)三個(gè)堿基序列對(duì)應(yīng)編碼一個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)5中心法則分子生物學(xué)的中心法則

（centraldogma）6阿瑟·科恩伯格。用實(shí)驗(yàn)證明ＤＮＡ的復(fù)制并分離了復(fù)制所需的酶，因此于1959年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。羅杰·科恩伯格。對(duì)基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)描述，他因此于2006年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。7DNA的復(fù)制DNA的損傷與修復(fù)重組DNA技術(shù)DNA的復(fù)制DNAreplication8主要內(nèi)容第一節(jié)DNA復(fù)制的幾個(gè)基本原則第二節(jié)參與DNA復(fù)制的一些酶類和蛋白質(zhì)第三節(jié)DNA復(fù)制過程

9第一節(jié)DNA復(fù)制的幾個(gè)基本原則（特點(diǎn)）10DNA的結(jié)構(gòu)及染色體的構(gòu)成11一、半保留復(fù)制

（Semiconservativereplication）二、半不連續(xù)復(fù)制（Semidiscontinuousreplication）三、RNA引物

（RNAprime）

四、復(fù)制的真實(shí)性

（Fidelityof

replication）121953年4月，JD.Watson和FHC.Crick英國自然雜志發(fā)表論文，建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。理論依據(jù)之一是堿基配對(duì)理論。DNA復(fù)制假說的提出。一、半保留復(fù)制（semi-conservativereplication）13子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式

全保留式半保留式混合式14密度梯度實(shí)驗(yàn)含15N-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液(含14N的NH4Cl)

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果實(shí)驗(yàn)依據(jù)：普通DNA的沉降位置普通DNA重DNA重DNA15AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

16

DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，DNA雙鏈每股鏈都可作為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則指導(dǎo)DNA新鏈的合成，這樣合成的兩個(gè)子代DNA分子，堿基序列與親代分子完全一樣。其中一條鏈來自親代的DNA鏈，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻逆湣６x:17模板：親代的DNA雙鏈(每股均可為模板)原則：按堿基配對(duì)原則(A-T、G-C)指導(dǎo)新鏈的合成特點(diǎn)：合成的兩個(gè)子代DNA分子堿基序列與親代分子完全一樣，但一條鏈來自于親代的DNA鏈，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻逆溞〗Y(jié):18按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義：遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。19二、半不連續(xù)復(fù)制(semidiscontinuousreplication)

1、(親代)DNA兩股鏈反向平行兩股子鏈反向平行5’3

’3’5’5’3’3’5’3’5’5’3’親代子代子代202、存在兩種DNA聚合酶？

5’

3’

3’

5’

*

體內(nèi)僅有5’3’DNA聚合酶*

所有DNA聚合酶只能催化5’3’方向合成3’5’

如何合成?21崗崎片段的發(fā)現(xiàn)(Okazakifragment)DNA復(fù)制中--1-2千核苷酸片段合成終止--連成一長鏈(崗崎片段)1968年,大腸桿菌223

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′前導(dǎo)鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)半不連續(xù)復(fù)制崗崎片段5′模板方向合成方向23DNA復(fù)制時(shí):

一股以3’5’方向的母鏈作為模板，指導(dǎo)新合成的鏈以5’3’方向

連續(xù)合成的鏈稱為前導(dǎo)鏈。前導(dǎo)鏈（leadingstrand）：（復(fù)制方向與解鏈方向一致）24隨從鏈（laggingstrand):

DNA復(fù)制時(shí)：一股以5’3’方向的母鏈作為模板，指導(dǎo)新合成的鏈沿5’3’方向，合成1000-2000個(gè)核苷酸不連續(xù)的小片段,這就是崗崎片段。隨著鏈的延伸,有許多崗崎片段組成的這條鏈稱為隨從鏈。（復(fù)制方向與解鏈方向相反)25

半不連續(xù)復(fù)制的定義：在DNA復(fù)制過程中，親代DNA分子中以3’5’方向的母鏈作為模板指導(dǎo)新的鏈以5’3’方向連續(xù)合成，另一股以5’

3’方向的母鏈則指導(dǎo)新合成的鏈以5’

3’方向合成1000—2000個(gè)核苷酸長度的許多不連續(xù)的片段（崗崎片段）,這種復(fù)制方式稱之為半不連續(xù)復(fù)制。26三、RNA引物DNA聚合酶a.不能催化兩個(gè)游離的dNTP聚合b.需要含3’-OH的引物(RNA)a.RNA聚合酶抑制物能抑制DNA合成*根據(jù)：b.崗崎片段5’段有RNA引物27RNA聚合酶a.

能催化兩個(gè)游離的NTP聚合b.其產(chǎn)物提供3’-OH圖12-31、DNA復(fù)制時(shí)先在RNA聚合酶催化下，以DNA為模板，合成一小片段的RNA，作為DNA合成的引物。283、RNA引物的作用：

1)為DNA聚合酶提供合成核苷酸所需的3’-

OH

2)可盡量減小DNA復(fù)制起始處的突變2、

RNA引物最后要被DNA聚合酶Ⅰ除去，空隙由該酶補(bǔ)滿，缺口再由DNA連接酶連接。29四、復(fù)制的真實(shí)性DNA的半保留復(fù)制遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律RNA引物DNA聚合酶在復(fù)制延長中對(duì)堿基的選擇功能復(fù)制出錯(cuò)時(shí)有即時(shí)的校讀功能(3’5’外切酶功能）DNA損傷的修復(fù)機(jī)制30第二節(jié)參與DNA復(fù)制的一些酶類和蛋白質(zhì)31底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP（dNTP）聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質(zhì)因子DNA復(fù)制的條件32DNA聚合酶:ⅠⅡⅢ(原核生物);

、

、

、

、(真核生物)解鏈、解旋酶和蛋白質(zhì):DNA解鏈酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ/Ⅱ引發(fā)體DNA連接酶酶和蛋白質(zhì)因子33DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol活性：5

3

的聚合酶活性核酸外切酶活性5

3

外切酶活性3

5

外切酶活性345′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′

3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?能從5

端切除DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。

核酸外切酶活性：

35DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)3’,5’-磷酸二酯鍵3’5’圖12-436一、大腸桿菌的DNA聚合酶（ⅠⅡⅢ）也稱為Kornberg酶活性：

1.

5

3

的聚合活性

2.

核酸外切酶活性1955年Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ簡稱為polⅠ37323個(gè)氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ38從3

端水解DNA產(chǎn)生3

單核苷酸，這種外切酶活性對(duì)保證DNA復(fù)制的真實(shí)性具有重要的意義。39校讀功能：DNA聚合酶在接上新的核苷酸之前，能對(duì)3’末端的堿基進(jìn)行識(shí)別。若為錯(cuò)配的堿基，即可通過3’5’外切酶活性把錯(cuò)配的堿基切除，再把正確的堿基聚合上去，保證DNA復(fù)制的高度真實(shí)性，這種功能也稱為校讀功能（proofreading)。40具有5’3’外切酶活性小片段可除去崗崎片段5’端的RNA引物在DNA損傷修復(fù)中起重要作用41

3’5’5’3’

外切酶

聚合酶NC

5’3’外切酶小片段大片段（klenow片段）切除RNA引物損傷修復(fù)校讀功能聚合功能DNA聚合酶I是多功能酶DNA聚合酶I的多肽鏈上具有三種酶活性

Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA、進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。42DNA-polⅢ

（DNAPolymeraseⅢholoenzyme）多聚酶10種不同亞基組成θαε－核心聚合酶τ－二聚體形式連接兩個(gè)核心聚合酶γ2δδ’χψ－單個(gè)運(yùn)載夾鉗DNA聚合酶Ⅲ※β(4個(gè))－星環(huán)狀,容納DNA雙鏈DNA聚合酶Ⅲ全酶43核心酶由

、

和

亞基組成：

亞基（130000）主要功能是合成DNA

亞基具有3

5

外切酶活性（校正功能）

亞基可增強(qiáng)其活性

亞基可能起組裝作用44功能：是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。1.

由多個(gè)亞基的全酶.成不對(duì)稱的二聚體每個(gè)單體都具有催化活性，一個(gè)作用于前導(dǎo)鏈，另一個(gè)作用于隨從鏈，使DNA兩

股鏈在同一地方同一時(shí)間進(jìn)行合成。45462.

是一種非常高的續(xù)進(jìn)性(processive)酶3.

催化活性比DNA聚合酶I高100倍4.

DNA聚合酶III是DNA復(fù)制的主要酶47(a)DNA聚合酶Ⅲ全酶空間結(jié)構(gòu)圖(b)DNA聚合酶Ⅲ全酶電子云實(shí)體模型48原核生物的DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅰ多功能酶5’3’外切酶3’5’外切酶

5’3’聚合酶單一肽鏈大小二個(gè)片段切除RNA引物，填補(bǔ)空缺損傷后修復(fù)DNA聚合酶Ⅲ多功能酶

5’3’聚合酶

3’5’外切酶

不對(duì)稱二聚體

單體1-前導(dǎo)鏈/單體2-隨從鏈DNA復(fù)制的主要酶

高續(xù)進(jìn)性

高聚合酶活性

高產(chǎn)物真實(shí)性49二、真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

負(fù)責(zé)隨從鏈的合成在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。負(fù)責(zé)線粒體DNA的復(fù)制DNA-pol

DNA-pol

和PCNADNA-pol

、

負(fù)責(zé)前導(dǎo)鏈的合成50三、解旋、解鏈酶類和蛋白質(zhì)DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用；復(fù)制不斷延伸，螺旋不斷解開－解鏈、解旋酶類保持解開模板的單鏈狀態(tài)－單鏈DNA結(jié)合蛋白解旋后在復(fù)制前方產(chǎn)生很大的張力，DNA發(fā)生纏結(jié)后－DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶51

１、DNA解鏈酶(DNAhelicase)

功能：解開DNA雙鏈，具有ATP酶的活性，每解開1對(duì)堿基消耗2個(gè)ATP。522、單鏈DNA結(jié)合蛋白

又稱螺旋去穩(wěn)定蛋白(helixdestabilizingprotein,HDP)作用1)與單鏈DNA結(jié)合,維持模板處于單鏈狀態(tài)，2)保護(hù)解開的單鏈模板不被核酸酶水解3)避免重新形成雙鏈；避免解開的單鏈自身發(fā)夾螺旋的形成4)使前端雙螺旋的穩(wěn)定性降低，易被解開

(singlestrandbindingprotein,SSB)533、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

108

局部解鏈后54解鏈過程中正超螺旋的形成55拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解、又能連接磷酸二酯鍵（可逆的核酸酶）分類

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ56作用機(jī)制

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端,DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。57四、引發(fā)體（primosome)DnaA

結(jié)合至復(fù)制起始部位

DnaB

具有解鏈酶的作用DnaC

協(xié)同DnaB引物酶是一種RNA聚合酶由多種蛋白質(zhì)及酶組成，是DNA復(fù)制開始所必需的。58

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaA/B/C蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

59五、DNA連接酶連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。605’3’OH5’3’

OO-POO-有缺口的DNA鏈DNA連接酶ATPAMP+PPi

OO

POO-5’3’缺口封閉61缺口填補(bǔ):連接雙股DNA分子中一鏈的缺口連接雙鏈DNA分子中雙鏈的缺口不能連接二分子單鏈DNA

62應(yīng)用:限制性內(nèi)切酶切割后形成的粘性末端或平末端的連接1.崗崎片段之間的連接2.DNA損傷修復(fù)中的連接3.一種重要的工具酶:

63

DNA連接酶的特點(diǎn):1）DNA連接酶連接雙鏈DNA分子中的一股鏈上的缺口,或雙鏈DNA分子雙股鏈的缺口2）DNA連接酶要求一條DNA鏈3’端有游離的

OH,

另一條鏈的5’

末端帶有磷酸根，使二者生成磷酸二酯鍵3）連接酶的催化作用需消耗ATP

4）DNA連接酶是一種重要的工具酶64第三節(jié)DNA復(fù)制過程651）復(fù)制的起始2）復(fù)制的延長3）復(fù)制的終止DNA復(fù)制過程66一、復(fù)制的起始大腸桿菌復(fù)制時(shí)有特定的起始部位稱oriC,復(fù)制從oriC開始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行的，稱為雙向復(fù)制（bi-directionalreplication）。圖12-104個(gè)9-bp的反向重復(fù)序列高度保守出現(xiàn)11次67DNA雙鏈復(fù)制起始點(diǎn)DNA雙鏈解開成單鏈DNASSB引物酶RNA引物/3’-OHDNA聚合酶ⅢdNTP和3’-OH形成3’5’磷酸二酯鍵

dnaAdnaB/dnaC解鏈、解旋酶拓?fù)洚悩?gòu)酶68復(fù)制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進(jìn)行復(fù)制，在電子顯微鏡下均看到DNA復(fù)制前進(jìn)部伸展成叉狀的復(fù)制現(xiàn)象，稱為復(fù)制叉(replicationfork)。12-11Y字形Y字形69真核細(xì)胞DNA分子巨大，有許多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行復(fù)制，形成多個(gè)復(fù)制單位。電鏡下觀察如眼泡狀。12-1212-1270二、復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，新合成的DNA鏈不斷延長。其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

大腸桿菌崗崎片段的長度為1000-2000個(gè)前導(dǎo)鏈合成1000-2000個(gè)核苷酸后，隨從鏈開始合成。

DNA聚合酶III為不對(duì)稱二聚體，每一個(gè)單體均可催化DNA合成，一個(gè)作用于前導(dǎo)鏈，另一個(gè)作用于隨從鏈。71前導(dǎo)鏈的合成72隨從鏈的合成735’3’3’5’圖12-13

74圖12-1475三、復(fù)制的終止RNA引物被DNA聚合酶I切除DNA聚合酶I填補(bǔ)空缺缺口由連接酶連接形成磷酸二酯鍵7677參與復(fù)制的酶類與蛋白質(zhì)78端粒(telomere):真核生物線性染色體的兩個(gè)末端每復(fù)制一次，新合成鏈的5’RNA引物被切除后，留下空缺。末端問題（真核生物阻止端?？s短的機(jī)制）四、真核生物端粒DNA的復(fù)制79802009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體的

伊麗莎白-布萊克本

卡蘿爾-格雷德杰克-紹斯塔克

811、端粒DNA的結(jié)構(gòu)和端粒酶端粒DNA的3’末端是由數(shù)百個(gè)串聯(lián)重復(fù)GT豐富的短的寡核苷酸組成，如四膜蟲為-GGGGTT-，人為-AGGGTT-。端粒DNA的生物學(xué)作用：維持染色體的穩(wěn)定性起著重要作用，保護(hù)DNA雙鏈末端，使其免遭端－端融合、降解、重排、染色體丟失等變化。82防止端粒縮短的酶端粒酶

RNA

作為合成端粒DNA的模板端粒酶

蛋白質(zhì)一種特殊逆轉(zhuǎn)錄酶，以其中RNA為模板催化合成端粒DNA

，具有種屬特異性

832、端粒酶的作用機(jī)制圖12-163.再發(fā)動(dòng)新一輪的合成延長,合成較長的重復(fù)序列DNA末端1.RNA和DNA單鏈互補(bǔ)序列識(shí)別結(jié)合2.以RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄過程84DNA聚合酶復(fù)制子鏈4.以延長的DNA單鏈為模板,3’-OH為引物合成富含CA的互補(bǔ)鏈進(jìn)一步加工DNA連接酶核酸酶G-T發(fā)夾85哺乳動(dòng)物中端粒末端形成大的環(huán)狀結(jié)構(gòu),環(huán)狀DNA+蛋白質(zhì)保護(hù)染色體3’端的穩(wěn)定圖12-17端粒的環(huán)狀結(jié)構(gòu)86端粒酶和衰老、腫瘤有關(guān)87第四節(jié)DNA的損傷和修復(fù)1.DNA雙鏈?zhǔn)荄NA修復(fù)的基礎(chǔ)2.DNA損傷是絕對(duì)的，而修復(fù)是相對(duì)的3.在DNA復(fù)制過程中修復(fù)DNA損傷可保持遺傳密碼的穩(wěn)定性88DNA修復(fù)的基礎(chǔ)一條鏈有損傷修復(fù)酶切除以未損傷的鏈為模板,合成與原來相同的序列89

1、自發(fā)的因素周圍環(huán)境溶劑分子的隨機(jī)熱碰撞

嘌呤堿脫落

胞嘧啶（C）自發(fā)脫氨成尿嘧啶（U）

一、造成DNA損傷的因素902、物理因素：

1)紫外線(UV)損傷產(chǎn)生嘧啶二聚體

2)電離輻射的損傷

產(chǎn)生堿基破壞、分子交聯(lián)和單鏈端裂等

91物理因素：紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV92(三)化學(xué)因素

*亞硝酸鹽(使胞嘧啶脫氨而成尿嘧啶)*5－溴尿嘧啶(5-BU)

*氮芥類93二、DNA損傷的類型點(diǎn)突變類型結(jié)果轉(zhuǎn)換----同型堿基顛換----異型堿基啟動(dòng)子/剪接信號(hào)影響整個(gè)基因功能編碼序列蛋白質(zhì)功能改變中性變化AA變化，功能不變靜止突變堿基變，AA不變94鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因95缺失插入倒位一個(gè)堿基/一段核苷酸/整個(gè)基因一段原來沒有的堿基/核苷酸序列DNA鏈內(nèi)部重組，一段方向顛倒96谷

酪

蛋

絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙

纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變97三、修復(fù)機(jī)制(一)光修復(fù)機(jī)制280nm239nm1、不需要光復(fù)活酶嘧啶單體嘧啶二聚體2、需要光復(fù)活酶嘧啶單體嘧啶二聚體光復(fù)活酶（+）98(二)切除修復(fù)（暗修復(fù)）1、DNA引起大的損傷，一般由切除修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)。2、對(duì)所有生物的生存是關(guān)鍵的。99OHPDNA聚合酶ⅠOHPDNA連接酶ATPE.coli的切除修復(fù)機(jī)制4個(gè)核苷酸8個(gè)核苷酸UvrAUvrBUvrC擴(kuò)創(chuàng)UV特異切割酶1001、切除修復(fù)是人體細(xì)胞最重要和有效的修復(fù)機(jī)制，主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。2、遺傳性疾病如著色性干皮病由于缺乏

UV特異核酸內(nèi)切酶。101(三)堿基切除修復(fù)

DNA糖苷酶識(shí)別切除改變的堿基核酸內(nèi)切酶切除磷酸二酯鍵

DNA聚合酶Ⅰ填補(bǔ)

DNA連接酶連接1022.識(shí)別的酶：（1）一類DNA糖苷酶（20種）各具特異性

e.g.尿嘧啶DNA糖苷酶—識(shí)別DNA中的U

（由C突變而來）（2）作用：識(shí)別-----DNA中改變的堿基水解-----改變的堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵改變的堿基脫落10312341043.DNA堿基的組成為何是“T”

？（1）DNA中的C脫氨容易突變成U，

造成子代DNA的突變G:CA:T（2）尿嘧啶DNA糖苷酶—識(shí)別DNA中的U

（由C突變而來）（3）若DNA中存在U，無法區(qū)別突變U和正常U（4）DNA中U甲基化/耗能生成T（5）DNA堿基中T的存在，

增加遺傳信息的穩(wěn)定性（6）RNA中的U：數(shù)量多/半衰期短/經(jīng)濟(jì)105基因重組技術(shù)作為分子醫(yī)學(xué)中最重要、最基本的技術(shù)之一，是許多分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)施的基礎(chǔ)，在基因診斷、治療和預(yù)防中具有舉足輕重的意義。

第五節(jié)重組DNA技術(shù)與基因工程106DNA重組（binationofDNA)自然界常見現(xiàn)象兩個(gè)DNA分子間/一DNA分子的兩個(gè)不同部位之間鏈斷裂/片段交換重接改變基因的組合和序列交換可發(fā)生在同一細(xì)胞內(nèi)（間）/不同生物107重組DNA技術(shù)(20世紀(jì)70年代)實(shí)驗(yàn)室，人工的方法不同來源/不同種屬的DNA片段

拼接成重組DNA分子引入活細(xì)胞內(nèi)

大量復(fù)制/表達(dá)108

現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P·Berg（美國,1926－）在1960年以敏銳的科學(xué)預(yù)見力提出一個(gè)大膽的設(shè)想：是否可以創(chuàng)造出一種人工方法，把外界的遺傳基因引入動(dòng)物體內(nèi)，以達(dá)到改變遺傳性狀和治療某些疾病的需要呢？1972年，伯格把兩種病毒的DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，首次實(shí)現(xiàn)兩種不同生物的DNA體外連接，獲得了第一批重組DNA分子，這標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。伯格因此獲得了1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

109

1973年，美國斯坦福大學(xué)教授S·Cohen和加州大學(xué)舊金山分校教授H·W·Boyer將兩個(gè)不同的質(zhì)粒（一個(gè)是抗四環(huán)素質(zhì)粒，另一個(gè)是抗鏈霉素質(zhì)粒）拼接在一起，組成嵌合質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌，當(dāng)該重組質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。這表明“雜合質(zhì)?！痹诖竽c桿菌的細(xì)胞分裂時(shí)也能自我復(fù)制。110

Cohen隨后以DNA重組技術(shù)發(fā)明人的身份向美國專利局申報(bào)了世界上第一個(gè)基因工程的技術(shù)專利。這標(biāo)志著自然界不同物種間在億萬年中形成的天然屏障被打破了，人類可以根據(jù)自己的意愿定向地改造生物的遺傳特性，甚至創(chuàng)造新的生命類型。

1977年，吉爾伯特（W·Gilbert）分別將編碼胰島素和干擾素的DNA經(jīng)過體外重新拼接后，導(dǎo)入大腸桿菌中，分別使大腸桿菌合成了胰島素和干擾素。

111

基因工程問世后的短短30年間，不僅催生了一個(gè)又一個(gè)基因工程的新成果，也催生了一個(gè)源于DNA研究的新興產(chǎn)業(yè)，導(dǎo)致眾多的生命科學(xué)高技術(shù)企業(yè)應(yīng)運(yùn)而生。到2001年年初，美國生物技術(shù)公司已有1400家，而這一數(shù)字還不包括為數(shù)更多的相關(guān)技術(shù)公司和傳統(tǒng)制藥公司，2000年底美國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的收入達(dá)到250億美元?？梢院敛豢鋸埖卣f，基因工程對(duì)生物、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都產(chǎn)生了革命性的影響，它對(duì)人們生活影響的深度和廣度早已超出了人們的想象。112

淡綠、橘黃、淺紅、金黃……用這些天然彩色蠶繭絲無需染色而織成色彩斑斕的綢緞，兼具華美外觀和環(huán)保內(nèi)質(zhì)。通過基因重組法選育高產(chǎn)彩色繭蠶品種獲成功。113

玫瑰的栽培歷史可以追溯到5000年前，但通過色素呈現(xiàn)出藍(lán)色的玫瑰卻從來沒有過。從藍(lán)色三葉草中提取制造藍(lán)色色素的基因，然后注入到玫瑰中，并成功地讓翠雀花素單獨(dú)顯色。114基因工程（geneticengineering）/遺傳工程

由于它可以把一個(gè)生物體中攜帶的某一特

定的遺傳信息，通過一定的方法轉(zhuǎn)移到另

一生物體中，使之獲得前者的遺傳特征,創(chuàng)

造新的遺傳組合，所以又稱基因工程。

克?。╟lone)

指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代

完全相同的子代群體。115基因工程－－當(dāng)代新興的學(xué)科領(lǐng)域1.基因與疾病的關(guān)系：2.生物制藥：100種以上人胰島素、促紅細(xì)胞生成素（1996年）3.疫苗研究：BCG疫苗4.環(huán)境監(jiān)測(cè)與凈化1161996年7月5日，世界上第一只克隆羊“多利”在英國蘇格蘭盧斯林研究所的試驗(yàn)基地誕生。117重組DNA技術(shù)的基本步驟

1.目的基因的獲得

2.目的基因與載體的連接

3.重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞

4.篩選出含重組DNA基因分子的受體細(xì)胞克隆

5.克隆基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)和分離純化118一、基因工程的基本步驟三個(gè)過程1.切與接2.轉(zhuǎn)3.篩圖12-211191、重組DNA分子的構(gòu)建目的基因+DNA載體重組分子(外源性DNA片段)(質(zhì)粒/病毒)120

(二)引入宿主細(xì)胞

重組分子

宿主細(xì)胞

轉(zhuǎn)化/感染/轉(zhuǎn)染(三)篩選挑選含重組分子的細(xì)胞克隆(擴(kuò)增/表達(dá))121

二、重組DNA分子的構(gòu)建

1、目的基因或DNA片段基因組(genomiclibrary)文庫從mRNA合成cDNA(complementarylibrary)和cDNA文庫人工合成PCR擴(kuò)增DNA片段或cDNA1222、載體（vector）質(zhì)粒，噬菌體(線狀雙鏈DNA病毒)，逆轉(zhuǎn)錄病毒存在細(xì)菌染色體外、散在分布小的雙鏈閉環(huán)DNA自我復(fù)制含有抗藥基因：抗氨芐青霉素基因、抗四環(huán)素基因

質(zhì)粒（plasmid）：123抗氨芐青霉素基因抗四環(huán)素基因圖12-22124

理想質(zhì)粒的條件：⑴多個(gè)單切口的限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)⑵含抗藥性標(biāo)志接入外源性DNA后，抗藥性消失⑶含有高效的自主復(fù)制序列

1253、常用工具酶

限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

DNA連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶

S1核酸酶(切單鏈DNA/RNA)

堿性磷酸酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)

126限制性內(nèi)切酶(restrictionenzyme

或restrictionendonuclease）限制性內(nèi)切酶是微生物的一種自我保護(hù)酶，它能識(shí)別雙鏈DNA分子中某一段特異堿基序列并切開。識(shí)別的DNA序列多數(shù)為4－6個(gè)堿基，也有8個(gè)堿基的。識(shí)別序列都具有回文結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。

“分子手術(shù)刀”127“分子剪刀”的發(fā)現(xiàn)者128命名原則：EcoRⅠ

細(xì)菌屬名

種名

株系

編號(hào)

識(shí)別DNA序列的堿基數(shù)：4—6個(gè)切除機(jī)率多

8個(gè)切除機(jī)率少分析大片段DNA識(shí)別序列：回文/雙重對(duì)稱結(jié)構(gòu)切口：粘性末端

平端末端129限制性內(nèi)切酶切口有兩種：

1.粘性末端(cohesiveend或stickyend)

2.平端末端(bluntend)

★平末端（bluntend)

在識(shí)別順序的對(duì)稱軸上，對(duì)雙鏈DNA同時(shí)切割。

HpaI

HpaI

5’GTTAAC3’5’GTT+AAC3’

3’CAATTG5’3’CAA

TTG5’

130★5’端粘性末端（cohesiveend)

在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的5’末端切割。

EcoRI

EcoRI

5’GAATTC3’5’G+pAATTC3’

3’CTTAAG5’3’CTTAAp

+G5’

131

★3’端粘性末端

在識(shí)別順序的雙側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對(duì)稱軸的3’末端切割。

PstI

PstI

5’CTGCAG3’5’CTGCA+pG3’

3’GACGTC5’