熒光蛋白的研究熒光蛋白的發(fā)展簡(jiǎn)史1熒光蛋白的結(jié)構(gòu)2熒光蛋白的分類3熒光蛋白的應(yīng)用4結(jié)論與展望5下村修1962年在維多利亞多管水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白(GFP)，并進(jìn)行純化。馬丁·沙爾菲第一次運(yùn)用綠色熒光蛋白這個(gè)神奇工具投入試驗(yàn)研究。1994年，改造GFP，使其熒光變強(qiáng)、變色。錢(qián)永健熒光蛋白的發(fā)展簡(jiǎn)史熒光蛋白的結(jié)構(gòu)圖1.野生型avGFP的結(jié)構(gòu)熒光蛋白的分類藍(lán)色熒光蛋白青色熒光蛋白綠色熒光蛋白黃色熒光蛋白橙色熒光蛋白紅色熒光蛋白遠(yuǎn)紅光熒光蛋白表1.部分熒光蛋白及其基本性質(zhì)1.亮度高的熒光蛋白藍(lán)色熒光蛋白EBFP

發(fā)光較弱，抗光漂白和抗酸性較差，用于細(xì)胞成像時(shí)背景信號(hào)高。幾個(gè)課題組針對(duì)EBFP開(kāi)發(fā)了3個(gè)更亮的突變體：Azurite，EBFP2，mTagBFP。熒光蛋白的應(yīng)用熒光蛋白分子的亮度由其量子產(chǎn)率與消光系數(shù)的乘積決定,與成像檢測(cè)靈敏度密切相關(guān)。圖2.Azurite突變體

圖3.EBFP2突變體

紅色系列熒光蛋白

對(duì)于橙色與紅色系列熒光蛋白，較早報(bào)道的紅色熒光蛋白(DsRed)的突變體有mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry和

mCherry。這些以水果命名的熒光蛋白表現(xiàn)出不同的光譜和理化特性，其中紅色熒光蛋白mCherry成熟快、單體特性好，已被廣泛應(yīng)用，但它的亮度較低。圖4.紅色熒光蛋白熒光蛋白的應(yīng)用由于熒光蛋白的發(fā)光團(tuán)結(jié)構(gòu)決定了它的光譜特性，從結(jié)構(gòu)上來(lái)設(shè)計(jì)熒光蛋白的突變位點(diǎn)，有可能獲得可見(jiàn)光光譜兩端的熒光蛋白突變體。開(kāi)發(fā)深紅色或者近紅外熒光蛋白對(duì)于活體生物成像更具價(jià)值。由于機(jī)體組織內(nèi)的血紅素在可見(jiàn)光波段有強(qiáng)吸收，而水和脂肪在紅外波段有強(qiáng)吸收，僅在近紅外光波段(650～900nm)的吸收系數(shù)最小且自發(fā)熒光最弱，被認(rèn)為是活體成像的“光學(xué)窗口”。2.可見(jiàn)光光譜兩端的熒光蛋白熒光蛋白的應(yīng)用

通過(guò)GFP-Phe66突變獲得了一個(gè)深藍(lán)色的熒光分子，但它的量子產(chǎn)率太低而無(wú)法使用。進(jìn)一步對(duì)其突變T65Q、Y145G、H148S

T203V位點(diǎn)后，得到了深藍(lán)色熒光蛋白Sirius，亮度比GFP-Phe66提高了25倍。圖5.深藍(lán)色熒光蛋白Sirius圖6.mKeima熒光蛋白熒光蛋白的應(yīng)用3.大stokes位移的熒光蛋白mKeima是最早報(bào)道的大Stokes位移的紅色熒光蛋白，它的發(fā)射與吸收峰分別位于440和620nm處。采用458nm的光源同時(shí)激發(fā)CFP與mKeima兩個(gè)熒光分子，能實(shí)現(xiàn)單光源的多色成像及熒光相關(guān)光譜(FCS)分析。但mKeima有兩個(gè)激發(fā)峰，另一個(gè)在584nm處，這不利于它的多色成像。不可逆光活化熒光蛋白熒光蛋白的應(yīng)用4.光轉(zhuǎn)換與光活化熒光蛋白Dronpa來(lái)源于Cnidaria，在強(qiáng)的藍(lán)光(470～510nm)作用下熒光淬滅形成暗態(tài)的分子。暗態(tài)的Dronpa在390nm處有吸收峰，受到400nm左右光照射時(shí)發(fā)生光活化，可回到起初的綠色熒光態(tài)，這種轉(zhuǎn)化可以反復(fù)多次進(jìn)行?？赡婀饣罨療晒獾鞍鬃钤鐖?bào)道的光活化熒光蛋白PA-GFP，屬于不可逆光活化熒光蛋白類。它經(jīng)過(guò)405nm的紫色光激活后，再用488nm的光激發(fā)成像，此時(shí)的發(fā)射光比激活前增強(qiáng)100倍，因而光活化區(qū)域與周邊未活化區(qū)域形成了很高的熒光對(duì)比度，為活細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)研究蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)提供了有效方法。圖7.PA-GFP的光敏化和活體成像圖8.PA-GFP的CLSM圖9.Dronpa光致變色的性質(zhì)結(jié)論與展望本文主要介紹了熒光蛋白的發(fā)展，結(jié)構(gòu)及分類，以及其在亮度、Stokes位移、光譜等特性方面的研究與發(fā)展，在光轉(zhuǎn)換與光激活熒光蛋白及其在超分辨熒光成像技術(shù)中的應(yīng)用?；铙w成像深度仍有局限性，為了提高分辨率，需要優(yōu)化出更合適于活體熒光成像的高亮度近紅外熒光蛋白分子。新型光學(xué)成像技術(shù)迫切需要具備新特性的熒光分子與之結(jié)合，以更大程度地提高成像的時(shí)空分辨率和檢測(cè)靈敏度。結(jié)論展望1.ShanerNC,.Improvedmonomericred,orangeandyellowfluorescentproteinsderivedfromDiscosomasp.redfluorescentprotein.NatBiotechnol,2004,22:1567~1572.2.ShroffH,GalbraithCG.Dual-colorsuperresolutionimagingofgeneticallyexpressedprobeswithinindividualadhesioncomplexes.ProcNatlAcadSciUSA,2007,104:20308~20313.3.BatesM,HuangB.Multicolorsuper-resolutionimagingwithphoto-switchablefluorescentprobes.Science,2007,317:1749~1753.4.MenaMA,TreynorTP,MayoSL,DaughertyPS.Bluefluorescentproteinswithenhancedbrightnessandphotostabilityfromastructurallytargetedlibrary.NatBiotechnol,2006,24:1569~1571.5.AiH,ShanerNC,ChengZ.Explorationofnewchromophorestructuresleadstotheidentificationofimprovedbluefluorescentproteins.Biochemistry,2007,46:5904~59106.SubachOM,GundorovIS,Conversionofredfluorescentproteinintoabrightblueprobe.ChemBiol,2008,15:1116~1124.7.TomosugiW,MatsudaT.

AnultramarinefluorescentproteinwithincreasedphotostabilityandpHinsensitivity.NatMethods,2009,6:351~353.8.KogureT,KarasawaS.AfluorescentvariantofaproteinfromthestonycoralMontiporafacilitatesdual-colorsingle-laserfluorescencecross-correlationspectroscopy.NatBiotechnol,2006,24:577~581.9.PattersonGH,Lippincott-SchwartzJA.PhotoactivatableGFPforselectivephotolabelingofproteinsandcells.Science,2002,297:1873~1877.10.SubachFV,PattersonGH.PhotoactivatablemCherryforhigh-resolutiontwo-colorfluorescencemicroscopy.N