青錢柳總黃酮測定方法研究李富民(南昌大學(xué)食品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西南昌330047)摘要：目的建立青錢柳總黃酮含量的測定方法。方法選用三種顯色方法用紫外可見分光光度法測定青錢柳總黃酮含量，通過對(duì)各種方法的比較得出了適合青錢柳總黃酮含量的測定方法。結(jié)果表明：三氯化鋁顯色法是一種簡便、準(zhǔn)確、快速的測定方法，比硝酸鋁顯色法更適合青錢柳總黃酮的測定。關(guān)鍵詞：青錢柳總黃酮顯色方法文章編號(hào)ThestudyondeterminationmethodsoftotalflavonoidsinCyclocaryapaliurus

LiFumin(KeyLaboratoryofFoodScienceofMinistryofEducation,NanchangUniversity,

Nanchang，Jiangxi330047,China)Abstract:ObjectiveDeterminationmethodofthecontentoftotalflavonoidswasobtained.MethodThreecolorimetriesofdeterminingthecontentoftotalflavonoidsbyultravioletspectrophotometrywerecomparedandaproperdeterminationmethodwasobtained.ResultAlCl3colorimetryissimple,exactandfast.ItisfittertodeterminetotalflavonoidsinCyclocaryapaliurusthanAl(NO3)3colorimetry.Keywords:Cyclocaryapaliurustotalflavonoidscolorimetry青錢柳CyeloearyapaLIuRus(Batal.)Iljinskaja.系雙子葉植物綱(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)植物［1］。青錢柳屬高大喬木(10~30m)。研究表明：其中含有豐富的天然藥用成份，如多糖、黃酮、酚類、植物蛋白(小肽)、皂苷、香豆精、生物堿、甾體、萜類、苷類，有機(jī)酸、胡蘿卜素、維生素E、咖啡因等和一些人體必需的微量元素⑵⑶。民間將其葉子經(jīng)類似茶葉加工的方法制成“保健茶”，該茶具有生津止渴、清熱解署、降壓強(qiáng)心及延年益壽的作用，可有效地用于防治糖尿病、高血壓、冠心病、神經(jīng)衰弱等疾病，被稱之為“降糖神茶”［4］。許多研究人員對(duì)青錢柳茶做生物學(xué)、藥理、治療毒性等試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)其藥用功能的成分主要為黃酮和多糖類物質(zhì)。因此對(duì)黃酮類物質(zhì)的研究是對(duì)青錢柳藥用價(jià)值開發(fā)的一個(gè)重要依據(jù)。關(guān)于黃酮類物質(zhì)的含量測定，一般常采用比色法和HPLC法，HPLC法儀器昂貴，而且標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品不易獲得，其應(yīng)用受到一定的限制。紫外可見分光光度法方便簡單，用于組成單一的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，結(jié)果準(zhǔn)確。謝明勇等用三氯化鋁顯色法測定過青錢柳黃酮甙的含量［6］，朱賁峰等用硝酸鋁顯色法測定過青錢柳總黃酮的含量［2］，但對(duì)于測定方法都沒做考察性試驗(yàn)。在比較和綜合前人的研究基礎(chǔ)上，通過不同顯色方法反復(fù)試驗(yàn)，建立了一種快速、簡便、準(zhǔn)確的測定青錢柳總黃酮的方法。收稿日期基金項(xiàng)目作者簡介1材料試劑與儀器1.1原料青錢柳：由江西神茶實(shí)業(yè)有限公司提供；1.2試劑蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇（分析純，中國上海振興化工一廠）；無水甲醇（分析純，中國上海振興化工一廠）；三氯化鋁（廣東汕頭市西隴化工廠）；氫氧化鈉（江西核工業(yè)試驗(yàn)化工廠）；硝酸鋁（廣東汕頭市西隴化工廠）；亞硝酸鈉（廣東汕頭市西隴化工廠）；超純水。1.3試驗(yàn)儀器TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；SHZ—III型循環(huán)真空泵（上海亞榮生化儀器廠）數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；TDL-5型離心沉淀機(jī)（上海飛鴿系列離心機(jī)廠）；FA1104電子天平（上海精天電子儀器廠）；DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Millipore超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。2方法與結(jié)果2.1樣品溶液的制備精確稱取約2g干燥的青錢柳粉末樣品，置于圓底燒瓶中，加入30mL70%乙醇溶液，浸潤后，在80°C水浴下回流4h。將提取抽濾之后，在4800r/min的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，真空濃縮至無醇味為止。置100mL容量瓶中，用70%乙醇定容，搖勻后作為樣品提取液。對(duì)照品溶液的制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取在120C干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5.5mg于50mL容量瓶中，用70%乙醇溶解稀釋定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液（每1mL含蘆丁0.11mg）。槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取在120C干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品3mg于25mL容量瓶中,用70%乙醇溶解稀釋定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液（每1mL含槲皮素0.12mg）。顯色方法的考察直接測定法分別取青錢柳黃酮提取液、蘆丁對(duì)照品溶液和槲皮素對(duì)照品溶液各1mL于3支10mL具塞試管中，甲醇定容，搖勻，10min后用雙光束紫外分光光度計(jì)在200?450nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，甲醇作空白液。記錄掃描圖見圖1。蘆丁在359nm和258nm處有兩個(gè)最大吸收峰，槲皮素在372nm和256nm處有兩個(gè)最大吸收峰，而樣品沒有很明顯的吸收峰，所以以甲醇為溶劑直接測定法不適合青錢柳總黃酮的測定。三氯化鋁顯色法分別取青錢柳黃酮提取液、蘆丁對(duì)照品溶液和槲皮素對(duì)照品溶液各1mL于3支10mL具塞試管中，加入1mL1%三氯化鋁（甲醇）液，甲醇定容，搖勻,15min后用在200?500nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以不加顯色劑的溶液為空白。掃描圖見圖2。經(jīng)比較選擇以蘆丁為測定時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品，以410nm處為最大吸收波長。

圖1圖1蘆丁、槲皮素和樣品均不加顯色劑的紫外可見光譜圖Fig.1UV/VISspectrasofRutin,quercetinandSamplebeforecomplexing2.3.3硝酸鋁顯色法圖2蘆丁、樣品和槲皮素三氯化鋁絡(luò)合后的紫外可見光譜圖Fig.2UV/VISspectrasofRutin,SampleandquercetinafterAlCl3complexing分別取青錢柳黃酮提取液、蘆丁對(duì)照品溶液和槲皮素對(duì)照品溶液各ImL于3支10mL具塞試管中，加60%的乙醇到5mL，加5%亞硝酸鈉0.3mL，搖勻，放置6min,力口10%硝酸鋁0.3mL，放置6min，加5%氫氧化鈉4mL,加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min后以不加樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的溶液為空白進(jìn)行掃描。掃描圖見圖3和圖4。蘆丁最大吸收在510nm處,槲皮素最大吸收在316nm處，樣品顯色后為暗紅色，經(jīng)過多次掃描得出樣品在500nm處有一很小的吸收峰。顯然樣品和蘆丁的最大吸收峰重合度更好，因此本方法選擇以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品在500nm處為最大吸收波長。圖3圖3樣品和蘆丁硝酸鋁絡(luò)合后的紫外可見光譜圖Fig.3UV/VISspectraofSample,Rutin

afterAl（NO3）3complexing2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2.4.1三氯化氯顯色法圖4槲皮素硝酸鋁絡(luò)合后的紫外可見光譜圖Fig.4UV/VISspectraofquercetin

afterAl(NO3)3complexing精確吸取0.11mg/mL蘆丁標(biāo)液0.0mL,0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL,2.5mL于6只10mL具塞試管中，加入1mL1%的三氯化鋁（甲醇液），搖勻，放置15min,以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為空白，于410nm波長下測定吸光度。以吸光度對(duì)蘆丁濃度作圖，得出蘆丁的回歸方程為A=0.02842C+0.00097,R2=0.9997，其線性范圍為0?275Ago2.4.2硝酸鋁顯色法精確吸取0.11mg/mL蘆丁標(biāo)液0.0mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL于6只10mL具塞試管中，加60%的乙醇到5mL，加5%亞硝酸鈉0.3mL,搖勻，放置6min,加10%硝酸鋁0.3mL，放置6min,加5%氫氧化鈉4mL,加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min。以零管為空白，于500nm波長下測定吸光度。以吸光度對(duì)蘆丁含量微克數(shù)作圖，以最小二乘法計(jì)算，得出其標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.01205C-0.00262,R2=0.9997,其線性范圍為0?560ago三氯化鋁顯色方法的考察精密度試驗(yàn)：精確移取0.5mL青錢柳樣品液（5個(gè)平行樣），按2.4.1中的方法顯色，在410nm處測定吸光度值，得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.669%,小于5.0%,說明該儀器的精密度較好。重現(xiàn)性試驗(yàn)：精密稱取青錢柳粉末4份，按樣品溶液制備方法處理，按2.4.1中測定方法測定吸光度。4個(gè)平行樣品測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.991%，小于5.0%，說明該方法的重現(xiàn)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精確吸取樣品溶液0.5mL和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL（平行3份），用三氯化鋁顯色法顯色15min后，用雙光束紫外可見分光光度計(jì)作時(shí)間掃描試驗(yàn)。如圖3所示。在90min之內(nèi)掃描結(jié)果基本為一條直線，說明吸光度值隨時(shí)間的變化基本保持不變，該方法穩(wěn)定性良好。圖5蘆丁和樣品A1C13絡(luò)合后的穩(wěn)定性Fig.5StabilityofRutinandsampleafterAlCl3complexing加標(biāo)回收率試驗(yàn)：精確移取0.5mL的青錢柳樣品溶液（平行4份），分別加入不同量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（0.11mg/mL）,搖勻，按2.4.1測定方法測定吸光度，得出平均回收率為100.186%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.227%。硝酸鋁顯色方法的考察精密度試驗(yàn)：精確移取0.5mL青錢柳樣品液（5個(gè)平行樣），按2.4.2中的方法顯色，在500nm處測定吸光度值。平行樣測得結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.102%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5%，說明儀器的精密度良好。重現(xiàn)性試驗(yàn)：精密稱取青錢柳粉末2g（平行4份），按供試液制備方法處理，然后按2.4.2中的方法測定吸光度。平行樣品測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.00%。穩(wěn)定性試驗(yàn)：精確吸取樣品溶液0.5mL和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL,用硝酸鋁顯色法顯色，15min后用雙光束紫外可見分光光度計(jì)做時(shí)間掃描，如圖6。蘆丁的吸光度值隨時(shí)間的變化基本保持不變，但樣品的吸光度值隨時(shí)間的變化一直減小，說明此方法顯色不是很穩(wěn)定。圖6蘆丁和樣品A1(NO3)3絡(luò)合后的穩(wěn)定性Fig.6StabilityofRutinandsampleafterAl(NO3)3complexing加標(biāo)回收率試驗(yàn)：精確移取0.5mL的青錢柳樣品溶液（平行5份），分別加入新配制的不同量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（O.llmg/mL）,搖勻，按樣液測定方法測定吸光度。得出平均回收率為93.096%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.996%。總黃酮含量的測定三氯化鋁顯色用移液管精確吸取樣液0.5mL于10mL刻度具塞試管中，加入1mL1%的三氯化鋁（甲醇液），搖勻，放置15min，于410nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出所取樣液中總黃酮含量。青錢柳總黃酮含量的計(jì)算：M（mg/g）=pXV—1000Xm其中p為樣品液質(zhì)量濃度（pg/mL）,由吸光度代入線性方程而得出；V為樣品液體積（mL）；m為青錢柳的質(zhì)量（g）。硝酸鋁顯色用移液管精確吸取樣液0.5mL于10mL刻度具塞試管中，加60%的乙醇到5mL，加5%亞硝酸鈉0.3mL,搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁0.3mL,放置6min，加5%氫氧化鈉4mL,加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min后在500nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出所取樣液中黃酮含量。計(jì)算方法如同2.4.1。兩種顯色方法測定青錢柳總黃酮含量結(jié)果見表1。硝酸鋁顯色法比三氯化鋁顯色法測定結(jié)果明顯偏高。表1兩種顯色方法測定的總黃酮含量Table1Thecontentoftotalflavonoidsdeterminedbytwomethods序號(hào)測定方法吸光度（A）總黃酮含量（mg/g）1三氯化鋁顯色0.538318.68492硝酸鋁顯色0.292624.21113討論3.1測定青錢柳總黃酮的三種顯色方法的原理大多數(shù)黃酮類化合物在甲醇中的紫外吸收光譜由兩個(gè)主要吸收帶組成。出現(xiàn)在300?400nm之間的吸收帶稱為帶I,出現(xiàn)在240?280nm之間的吸收帶稱為帶II。不同類型的黃酮化合物的帶I和帶II的峰位、峰形和吸收強(qiáng)度不同，因此從紫外光譜可以推測黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)類型［7］。但是試驗(yàn)表明：直接加甲醇進(jìn)行掃描樣品沒有明顯的吸收峰，可能是樣品成分太復(fù)雜了，有好多雜質(zhì)也在掃描的波段有吸收。顯然這種顯色方法不適合青錢柳總黃酮的測定。黃酮類化合物的甲醇（或乙醇）溶液中加入三氯化鋁試劑時(shí)，能使黃酮的酚羥基離解或形成絡(luò)合物，導(dǎo)致光譜發(fā)生變化。三氯化鋁可與具有3-羥基、4-羰基或5-羥基、4-羰基的黃酮或黃酮醇類化合物作用生成絡(luò)合物。三氯化鋁也能與A環(huán)或B環(huán)上的鄰二酚羥基作用生成絡(luò)合物，使相應(yīng)的吸收帶向紅移，但鄰二羥基與三氯化鋁形成的絡(luò)合物沒有3-羥基、4-羰基或5-羥基、4-羰基形成的絡(luò)合物穩(wěn)定，當(dāng)加入鹽酸后可分解（少數(shù)例外），使相應(yīng)的吸收帶向紫位移［7］。所以顯色試劑只選擇三氯化鋁，而不用三氯化鋁-鹽酸體系。還有一些黃酮類物質(zhì)如：異黃酮類、黃烷酮、兒茶素等在可見區(qū)和三氯化鋁作用不顯色［8］，這可能會(huì)使測定結(jié)果偏小。硝酸鋁顯色法是先用NaNO2還原黃酮，再加Al（NO3）3絡(luò)合，最后加NaOH溶液使黃酮類化合物開環(huán)，生成2'-羥基查耳酮而顯色［8］。總黃酮含量就是多個(gè)黃酮類成分的總量，非黃酮類成分不應(yīng)該和該試劑發(fā)生反應(yīng)，在所選最大吸收波長處不應(yīng)有吸收。郭亞健等選用多種黃酮及非黃酮化合物,與NaNO2-Al（NO3）3-NaOH試劑反應(yīng)后測定400?600nm吸收曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)某些黃酮類物質(zhì)(黃芩苷、黃芩素、香蒲新苷、山奈酚、槲皮素、橙皮苷等)在500nm處無最大吸收或吸收很弱,而某些非黃酮類物質(zhì)(咖啡酸、原兒茶醛、綠原酸、原兒茶酸等)在500nm處有最大吸收或較強(qiáng)吸收，香草醛、阿魏酸等也有一定吸收[9]。說明此方法專屬性不強(qiáng)，有局限性，準(zhǔn)確性較差。經(jīng)過試驗(yàn)證明，以NaNO2-A1(NO3)3-NaOH為顯色體系，于500nm處測定青錢柳中總黃酮含量與其他方法相比較偏高，可能是因?yàn)榍噱X柳里含有許多在此處顯色的非黃酮類物質(zhì)，引起結(jié)果偏大。3.2青錢柳總黃酮測定方法的考察對(duì)測定青錢柳總黃酮的兩種顯色方進(jìn)行精密度