第二十一章細(xì)胞凋亡及其調(diào)控的分子機(jī)制細(xì)胞死亡方式細(xì)胞壞死(necrosis)細(xì)胞凋亡(apoptosis)細(xì)胞凋亡是能量依賴的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞自殺，由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動(dòng)死亡過程。程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath)PCD最初是1951年GlucksmanA在發(fā)育生物學(xué)中提出的概念，是個(gè)功能性概念，強(qiáng)調(diào)的是其分子生物學(xué)和生理功能，一般指生理性細(xì)胞死亡。描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成局部。自噬性細(xì)胞死亡(autophagy)是指細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏或應(yīng)激條件下，借助消化自身細(xì)胞器或大分子成分獲得能量以渡過“饑荒〞的行為。程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath)SydneyBrenner

JohnE.Sulston

"fortheirdiscoveriesconcerning'geneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath'"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicinein2002H.RobertHorvitz

王曉東教授現(xiàn)任美國德克薩斯西南醫(yī)學(xué)中心〔達(dá)拉斯〕生物醫(yī)學(xué)研究生院終身教授，并在霍華德·休斯研究所擔(dān)任研究員。王曉東教授主要研究成果集中在對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的生化調(diào)控機(jī)制和通路的研究?，F(xiàn)年41歲的王曉東教授2004年4月21日中選為美國科學(xué)院最年輕的院士，同時(shí)也是我國近20年來的出國留學(xué)人員中第一位中選為美國科學(xué)院院士的學(xué)者〔摘自中新網(wǎng)〕。王曉東教授1984年畢業(yè)于北京師范大學(xué)〔生物學(xué)〕，1991年獲得美國德克薩斯西南醫(yī)學(xué)中心生物化學(xué)博士學(xué)位。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別特征細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素生理及弱刺激強(qiáng)烈刺激受累范圍單個(gè)細(xì)胞喪失成群細(xì)胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細(xì)胞體積減少、固縮增大腫脹染色質(zhì)凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細(xì)胞器無明顯變化腫張破壞溶酶體保持完整破壞外溢細(xì)胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機(jī)降解大分子合成一般需要不需要基因調(diào)控有無后果不引起炎癥反響引起炎癥反響意義生理死亡方式病理死亡方式細(xì)胞凋亡的根本特征凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征凋亡細(xì)胞的生物化學(xué)特征1.非隨機(jī)性DNA降解2.細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻3.正常的能量代謝4.胞漿蛋白交聯(lián)細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征〔1〕凋亡的起始；微絨毛的消失，細(xì)胞間接觸的消失，與周圍的細(xì)胞脫離，細(xì)胞質(zhì)中，線拉體大體完整，染色質(zhì)固縮，〔2〕細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜外表，〔3〕凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞膜所包圍?！?〕凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化核濃縮染色質(zhì)斷裂細(xì)胞體積縮小出現(xiàn)凋亡小體

細(xì)胞凋亡DNA的片段化磷脂酰絲氨酸〔PS〕外翻分析〔AnnexinV法〕

磷脂酰絲氨酸〔Phosphatidylserine,PS〕正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，在凋亡早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素〔FITC、R-PE〕或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡的過程及機(jī)理接受凋亡信號(hào)凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶〔caspases〕的活化凋亡的級(jí)聯(lián)反響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)因素受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺〔第二信使〕胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活凋亡程序死亡信號(hào)啟動(dòng)預(yù)定程序凋亡相關(guān)基因激活酶合成核酸內(nèi)切酶激活Caspases激活DNA切割細(xì)胞解體凋亡基因激活執(zhí)行凋亡清除細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制雖然還不十分清楚，但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細(xì)胞凋亡的過程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反響過程。半胱氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽鍵，因此又稱之為Caspases(取英文CysteineC，asparticacid，Asp，proteases的詞頭)Caspase家族的結(jié)構(gòu)與分類ICE亞類Caspase蛋白酶：ICE是單核細(xì)胞來源的參與成熟的一種蛋白酶，參與凋亡但不起主要作用；Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11Caspase12，Caspase13，Caspase14。凋亡啟動(dòng)亞類Caspase蛋白酶：Caspase8，Caspase2，Caspase9，Caspase10。凋亡效應(yīng)亞類Caspase蛋白酶：Caspase3，Caspase6，Caspase7Caspase家族的特點(diǎn)

以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和異源活化,活化后形成四聚體的蛋白水解酶，發(fā)揮生物學(xué)作用C端同源區(qū)存在半光氨酸激活位點(diǎn)Caspase分：啟動(dòng)酶和效應(yīng)酶

活性中心破壞細(xì)胞抗凋亡因素正?；罴?xì)胞因核酸酶處于無活性狀態(tài)，這是由于核酸酶和抑制物結(jié)合在一起，如抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化?，F(xiàn)知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶〔caspase-activateddeoxyribonuleaseCAD〕，而把它的抑制物稱為ICAD。有意義的是CAD只在ICAD存在時(shí)才能合成并顯示活性，因而ICAD對CAD的活化與抑制是必需要的。破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如裂解核纖層，核纖層〔Lamin〕是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)〔chromatin〕得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核纖層蛋白作為底物被Caspase裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。6影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能Caspase可作用于多種與DNA，RNA功能有關(guān)的蛋白如滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細(xì)胞的增殖與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡途徑死亡受體途徑線粒體途徑病毒感染等化學(xué)毒物、射線死亡受體途徑膜受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭蛋白：〔死亡結(jié)構(gòu)域蛋白deathdomainprotein〕TRADD：TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白TNF+TNFRI〔死亡結(jié)構(gòu)域〕+TRADD—細(xì)胞凋亡FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白FasL+Fas〔死亡結(jié)構(gòu)域〕+FADD—細(xì)胞凋亡RIP：受體相互作用蛋白CRADD：含有死亡結(jié)構(gòu)域的caspase和RIP接頭蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白細(xì)胞凋亡的膜受體通路FASL+FAS+FADD凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物〔DISC〕胞質(zhì)中游離的caspase8聚集到這個(gè)復(fù)合物上細(xì)胞有足夠caspase8細(xì)胞caspase8濃度不夠死亡受體活化，切割BidtBid從胞質(zhì)到線粒體細(xì)胞凋亡CtyC釋放

細(xì)胞凋亡線粒體途徑凋亡的調(diào)控凋亡相關(guān)基因抑制凋亡基因：Bcl-2，EIB，

IAP促進(jìn)凋亡基因：wtP53，Bax，ICE雙向調(diào)控基因：c-myc，Bcl-x一、BcL-2族分子

BcL-2:bcL-2基因是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一,其表達(dá)的蛋白質(zhì)BcL-2蛋白最初發(fā)現(xiàn)于B-淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2〔Bcelllymphoma/Leukemia-2,BcL-2)而得名，與線蟲ced9基因表達(dá)的Ced-9分子在結(jié)構(gòu)上有同源性，具有抗凋亡作用。BcL-2的高表達(dá)能阻抑多種凋亡誘導(dǎo)因素所引發(fā)的細(xì)胞凋亡。如γ-射線、糖皮質(zhì)激素、熱休克、多種化療藥物。抑制凋亡基因BcL-2的同源基因和蛋白

其中一類呈抗凋亡作用，有BcL-2,BcL-w，BcL-XL、BFL-1、Brag-1、MCL-1，AI。

另一類呈現(xiàn)促凋亡作用的，有Bax，Bak,Bok，BcL-Xs，Bad,Bid,Bik，Hrk，Bim等。

BcL-2基因家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，BcL-2家族的蛋白與蛋白相互作用調(diào)節(jié)著細(xì)胞的存活與凋亡。BcL-2抗凋亡機(jī)制：直接抗氧化抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)抑制凋亡調(diào)節(jié)蛋白的細(xì)胞毒作用抑制凋亡蛋白酶的激活維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)P53基因wtP53——修復(fù)受損的DNA，如修復(fù)失敗那么誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡突變的P53失活的P53喪失監(jiān)視DNA損傷的功能射線，毒素P53蛋白+細(xì)胞凋亡分子警察促進(jìn)凋亡基因雙向調(diào)控基因C-myc是一種癌基因，是調(diào)控細(xì)胞周期的主要基因。編碼的蛋白是DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在GF充足時(shí)主要激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因；反之激活凋亡基因。

C-mycBcl-x是1933年發(fā)現(xiàn)的一類與Bcl-2相關(guān)基因。Bcl-xl——抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-xs——促進(jìn)細(xì)胞凋亡。八.細(xì)胞凋亡的檢測方法一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測二、磷脂酰絲氨酸外翻分析〔AnnexinV法〕三、線粒體膜勢能〔mt〕的檢測四、DNA片斷化檢測五、TUNEL法六、細(xì)胞凋亡峰的檢測七、Caspase-3活性的檢測八、WB檢測

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測

1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。3電子顯微鏡觀察NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess〔488nm400〕電鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。磷脂酰絲氨酸〔PS〕外翻分析〔AnnexinV法〕

磷脂酰絲氨酸〔Phosphatidylserine,PS〕正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，在凋亡早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素〔FITC、R-PE〕或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。AnnexinV-FITCFluorescencePIFluorescence

TimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemediumApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PI線粒體膜勢能〔mt〕的檢測

線粒體熒光染料：Rhodamine123、DiOC6〔3〕、JC-1、TMRM等對線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。DNA片段化分析

細(xì)胞凋亡時(shí)主要生物化學(xué)特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成180

200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。細(xì)胞凋亡與人類疾病細(xì)胞凋亡受抑制有關(guān)的疾病

惡性腫瘤:濾泡性淋巴瘤、乳腺癌、白血病等自身免疫性疾?。合到y(tǒng)性紅斑狼瘡、腎炎病毒感染性疾?。合俨《静?、庖疹病毒病細(xì)胞凋亡增多有關(guān)的疾病

艾滋?。荷窠?jīng)變性性疾?。涸缋闲赃t呆、帕金森病、小腦退化病骨髓發(fā)育不全性疾病缺血性疾病酒精中毒性肝炎㈢細(xì)胞凋亡缺乏與過度并存由于細(xì)胞類型的差異，各種細(xì)胞在致病因子作用下，有些可表現(xiàn)為凋亡缺乏，而另一些細(xì)胞可表現(xiàn)為凋亡過度，因此同一疾病或病理過程中兩種情況也可同時(shí)存在。例如：動(dòng)脈粥樣硬化〔atherosclerosis,AS〕AS——血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過度而血管平滑肌細(xì)胞凋亡缺乏血脂↑〔oxLDL〕血流動(dòng)力學(xué)改變動(dòng)脈內(nèi)膜功能受損血管內(nèi)皮解剖性損傷單核C粘附、移行內(nèi)膜下內(nèi)皮下膠原暴露吞噬LDL成為泡沫C血小板激活