犬內(nèi)服藥物生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)溶解度測(cè)定和分類本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了基于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、犬內(nèi)服藥物生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)溶解度測(cè)定和分類的影響因素、試驗(yàn)操作、分類方法等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于犬內(nèi)服藥物生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)溶解度測(cè)定和分類的相關(guān)工作。2.縮略語(yǔ)表縮略語(yǔ)英文名稱中文名稱BCSBiopharmaceuticsClassificationSystem生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)MRIMagneticResonanceImaging核磁共振GIGastrointestinalRTRepetitionTime重復(fù)時(shí)間TEEchoTime回聲時(shí)間FOVFieldofView視場(chǎng)APIActivePharmaceuticalIngredients原料藥HPLCHighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜LODLimitofDetection最低檢測(cè)限LOQLimitsofQuantification最低定量限BEBioequivalence生物等效性MDCKMadin-DabyCanineKidneyCell犬腎上皮細(xì)胞Medium199M-199細(xì)胞培養(yǎng)基HBSSHanksBalancedSaltSolution漢克斯緩沖液K-RKrebs-RingerBuffer林二氏緩沖液TEERTrans-epithelialElectricalResistance跨上皮電阻APApical頂端BLBasolateral基底3儀器3.1高效液相色譜儀3.2色譜柱AgilentSBC18(250mm×4.6mm×5μm)3.3電子分析天平3.4微型pH測(cè)定儀3.5數(shù)顯恒溫?fù)u床3.6核磁共振儀3.7體重秤3.8微型離心機(jī)3.9水銀溫度計(jì)3.11二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱3.12超凈臺(tái)4試劑4.1鹽酸（分析純）4.2氫氧化鈉（分析純）4.3磷酸（分析純）4.4磷酸二氫鉀（分析純）4.5磷酸氫二鈉（分析純）4.6磷酸二氫鈉（分析純）4.7氨水（分析純）4.8甲酸（分析純）4.9甲醇（色譜純）4.10乙腈（色譜純）4.11水合氯醛（醫(yī)用級(jí)）4.12戊巴比妥鈉（醫(yī)用級(jí)）4.13凡士林（分析純）4.14Krebs-Ringer緩沖液4.15HBSS緩沖液4.16其他試劑均為分析純5對(duì)照品與原料藥5.1.2鹽酸四環(huán)素5.1.3鹽酸多西環(huán)素5.1.5氟苯尼考5.1.6替米考星5.1.7磺胺嘧啶5.1.8磺胺對(duì)甲氧嘧啶鈉5.1.9磺胺二甲氧嘧啶鈉5.1.10磺胺間甲氧嘧啶5.1.11磺胺氯噠嗪鈉5.1.12磺胺甲噁唑5.1.13二甲氧芐啶5.1.16美托洛爾5.2原料藥5.2.1土霉素5.2.2鹽酸四環(huán)素5.2.3鹽酸多西環(huán)素5.2.4甲砜霉素5.2.5氟苯尼考5.2.6替米考星5.2.7磺胺嘧啶5.2.8磺胺對(duì)甲氧嘧啶鈉5.2.9磺胺二甲氧嘧啶鈉5.2.10磺胺間甲氧嘧啶5.2.11磺胺氯噠嗪鈉5.2.12磺胺甲噁唑5.2.13二甲氧芐啶5.2.14恩諾沙星5.2.16美托洛爾6溶液的配制6.1不同pH水性緩沖溶液的配制方法見附錄A。pH2.0磷酸鹽緩沖液（按照附錄A.1配制）pH5.0磷酸鹽緩沖液（按照附錄A.2配制）pH6.8磷酸鹽緩沖液（按照附錄A.3配制）pH7.0磷酸鹽緩沖液（按照附錄A.4配制）pH7.4磷酸鹽緩沖液（按照附錄A.5配制）pH7.8磷酸鹽緩沖液（按照附錄A.6配制）6.2細(xì)胞滲透液配制pH=6.4：準(zhǔn)確量取1000mLK-R緩沖液，逐滴滴加0.2mol/L鹽酸調(diào)pH為6.4。pH=7.0：準(zhǔn)確量取1000mLK-R緩沖液，逐滴滴加0.2mol/L鹽酸調(diào)pH為7.0。7藥物HPLC測(cè)定方法7.1測(cè)定條件根據(jù)查閱文獻(xiàn)結(jié)合《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》以及2015年版《中國(guó)獸藥典》，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，建立17種犬常用藥物的HPLC條件，具體的HPLC條件見附錄B。7.2HPLC方法學(xué)考核7.2.1專屬性取適量貯備液，添加一定體積稀釋液稀釋至不同濃度，相應(yīng)稀釋液作為空白對(duì)照，比較空白樣品與樣品色譜圖，以藥品出峰時(shí)間處無(wú)雜質(zhì)干擾為準(zhǔn)，確定方法的特異性。7.2.2線性范圍取空白pH緩沖液，添加適量藥物貯備液，稀釋成一系列不同濃度的工作液，渦旋1min~2min，0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，每個(gè)濃度3次重復(fù)，將對(duì)應(yīng)濃度與平均峰面積值作線性回歸，得線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)。7.2.3靈敏度精確量取藥物工作液備用，用特定稀釋液稀釋成一系列不同濃度的工作液樣品，每個(gè)濃度3次重復(fù)，記錄測(cè)得的信號(hào)強(qiáng)度S與背景信號(hào)強(qiáng)度N，以S/N≥3時(shí)樣品濃度為最低檢測(cè)限(Limitofdetection，LOD)。以S/N≥10時(shí)樣品濃度為最低定量限(Limitofquantitation，LOQ)。7.2.4精確度取空白稀釋液，添加適量的藥物標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配置低、中、高3個(gè)濃度，各5份，每天測(cè)定1次連續(xù)測(cè)定3天，取平均值，計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)與日間變異系數(shù)以及回收率。8藥物溶解度測(cè)定過程8.1生理常數(shù)測(cè)定本研究采用12只健康Beagle犬（公母各6只體重9kg~12kg，采用12h光暗周期飼養(yǎng)。核磁共振(MRI)掃描前16小時(shí)禁食，并在掃描前4小時(shí)停止供水。稱重并記錄后，先肌肉注射含量為10%的水合氯醛(0.1mL/kg)，2min后靜脈注射戊巴比妥鈉(0.05mL/kg)麻醉。該方法已被證實(shí)對(duì)胃腸道分泌的影響可以忽略不計(jì)。。8.1.2胃液體積的測(cè)量使用MRI掃描儀進(jìn)行圖像掃描。將犬置于俯臥位，腹部纏繞一個(gè)雙通道偏振圓線圈。橫斷面和矢狀面掃描參數(shù)為重復(fù)時(shí)間(TR)1100ms，回聲時(shí)間(TE)122ms，層厚4mm，無(wú)層間隙，視場(chǎng)(FOV)308mm~380mm。冠狀面掃描的特征序列為TR為4.5ms,TE為2.25ms。每只掃描時(shí)間為15min。掃描完成后，每只犬灌胃水100mL，穩(wěn)定2min，重復(fù)上腹部掃描。掃描期間，至少有一人在場(chǎng)觀察犬在緊急情況下的狀態(tài)。使用Amira6.0.1圖形軟件處理核磁圖像，該軟件自動(dòng)識(shí)別所有包含液體的區(qū)域并生成三維模型，并直接給出模型的體積數(shù)據(jù)。使用GraphPadPrism7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析胃液體積并以平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。8.1.3體溫與胃腸道pH的測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉前進(jìn)行體溫測(cè)量。在水銀溫度計(jì)前均勻涂抹凡士林保持潤(rùn)滑，旋轉(zhuǎn)入直腸5cm~8cm，直至獲得穩(wěn)定讀數(shù)。采用外科手術(shù)方法將麻醉犬的腹腔切開約10cm的開口，依次暴露胃、十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸，將微pH探針插入相應(yīng)腸內(nèi)容物中測(cè)量各腸段的pH值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有的動(dòng)物交由獸醫(yī)護(hù)理直到完全康復(fù)。8.2藥物平衡溶解度檢測(cè)準(zhǔn)確稱取藥物的單次最大使用劑量，記錄后置于50mL錐形瓶中，加入24mL的pH為3~7.8的緩沖介質(zhì)，在溫度為38.5℃±0.5℃,在轉(zhuǎn)速為30r/min的38.5℃水恒溫水浴搖床中振搖24h后，再在該溫度下靜置2h，取上清液離心，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，每種藥物按《中國(guó)獸藥典》2015版規(guī)定的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。緩沖液根據(jù)中國(guó)獸藥典規(guī)定的常用不同pH緩沖液配制方法進(jìn)行配制，具體見附錄A。8.3計(jì)量數(shù)（Do）的計(jì)算將收集的溶液用10000r/min離心，離心5min，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾后于HPLC進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)以下公式計(jì)算藥物的計(jì)量數(shù)：s式中：式中M為固體藥物的最高劑量強(qiáng)度，V0為給藥體積(24mL)，Cs為藥物的平衡溶解度(mg/mL)。9溶解度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)和分類根據(jù)MRI掃描犬的胃液體積，得到胃液體積為24.0mL；在體腸道測(cè)量法得到犬在禁食與進(jìn)食兩種狀態(tài)下胃腸道各部分（胃、十二指腸、空腸了、回腸）的pH值，使用肛門測(cè)溫法測(cè)得犬的核心體溫。結(jié)合人用藥物BCS中胃腸道生理學(xué)常數(shù)研究，制定出犬口服藥物生理學(xué)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，并得到犬用藥物體外溶解度標(biāo)準(zhǔn)，即單次給藥最大劑量可在38.5℃,pH3.0~7.8時(shí)完全溶解在24.0mL液體中。根據(jù)建立的溶解度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)17種犬口服藥物的Do值，并對(duì)其進(jìn)行溶解度分類。10BCS溶解度分類標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)FDA指導(dǎo)原則，溶解度高低的判定用計(jì)量數(shù)Do表示，本研究以此為依據(jù)建立犬常用內(nèi)服藥物BCS溶解度標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)計(jì)量數(shù)的數(shù)值，Do≥1的藥物被分為低溶解度，Do<1的為高溶解度。11藥物滲透系數(shù)（Papp）測(cè)定過程11.1細(xì)胞的培養(yǎng)根據(jù)調(diào)研文獻(xiàn)提供方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)方法見附錄C。將第10~15代的LLC-PK1細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS和1%青霉素鏈霉素的M199中。所有細(xì)胞均在溫度為37℃,CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。將LLC-PK1細(xì)胞以8×104細(xì)胞/cm2的密度接種在Transwell板的聚碳酸酯膜上，并分別在細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。通過跨上皮電阻（TEER）值評(píng)估細(xì)胞單層的生長(zhǎng)狀態(tài)，并在TEER值大于300Ω/cm2時(shí)用于滲透研11.2藥物在細(xì)胞模型上的滲透性測(cè)定將HBSS緩沖液用于基底外側(cè)(BL)一側(cè)，K-R緩沖液（pH6.4和7.0）用于頂端(AP)一側(cè)。在實(shí)驗(yàn)之前，除去細(xì)胞培養(yǎng)基并用空白緩沖液沖洗，然后與空白緩沖液一起溫育15min。15min后，用0.5mL藥物溶液（pH6.4或7.0）替換AP側(cè)的空白緩沖液，并在BL側(cè)添加1.5mLHBSS緩沖液用于AP-BL方向研究。將BL側(cè)的空白緩沖液替換為1.5mL含藥物的HBSS緩沖液，并將0.5mL的空白緩沖液（pH6.4和7.0）添加到AP側(cè)以用于BL-AP方向研究。每隔15min(15、30、45、60、75、90、105和120min)從空白緩沖液一側(cè)收集樣品，并及時(shí)補(bǔ)充相同體積的空白緩沖液。在第120min時(shí)收集供體側(cè)的樣品，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即通過HPLC分析所有樣品。11.3滲透系數(shù)（Papp）的計(jì)算將收集的滲透液10000r/min，25℃,離心5min，吸取上清液，0.22μm濾膜過濾后于HPLC進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)以下公式計(jì)算藥物的滲透性：式中：其中dQ/dt是藥物在接收器腔室中的出現(xiàn)率(μmol/s)，C0是供體隔室中的初始濃度(μmol/mL)，A是細(xì)胞培養(yǎng)插入物的滲透面積(cm2)。12滲透性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)和分類美托洛爾是被國(guó)際認(rèn)可的用于區(qū)分藥物滲透性高/低的邊界性藥物（Papp值高于美托洛爾則被分為高滲透性，反之為低滲透性）。利用LLC-PK1細(xì)胞模型測(cè)定藥物的滲透性，并以Papp值表示，將各模型藥物在不同濃度和pH時(shí)的Papp值與美托洛爾進(jìn)行比較并建立滲透性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。其中藥物濃度根據(jù)藥物最高給藥劑量的1、0.1和0.01倍而設(shè)定，而pH則分別為犬胃腸道的平均值與最高值。根據(jù)建立的滲透性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)17種犬口服藥物的Papp值，并對(duì)其進(jìn)行滲透性分類。13BCS分類利用確定的溶解度分類標(biāo)準(zhǔn)和滲透性分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)17種犬口服藥物進(jìn)行BCS分類。附錄A（規(guī)范性）緩沖溶液的配制方法A.1pH2.0磷酸鹽緩沖液：甲液：取磷酸16.6mL，加水至1000mL，搖勻；乙液：取磷酸氫二鈉71.63g，加水使溶解成1000mL。取上述甲液72.5mL與乙液27.5mL，搖勻，即得。A.2pH5.0磷酸鹽緩沖液：取0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液一定量，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH至5.0，即得。A.3pH6.8磷酸鹽緩沖液：取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250mL，加0.2mol/L的氫氧化鈉溶液118mL，用水稀釋至1000mL，即得。A.4pH7.0磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液29.1mL，用水稀釋至100mL，即得。A.5pH7.4磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀1.36g，加0.1mol/L的氫氧化鈉溶液79mL，用水稀釋至200mL，即得。A.6pH7.8磷酸鹽緩沖液：甲液：取磷酸氫二鈉35.9g，加水溶解并稀釋至500mL；乙液：取磷酸二氫鈉2.76g，加水溶解并稀釋至100mL。取上述甲液91.5mL與乙液8.5mL混合，搖勻，即得。（規(guī)范性）MDCK細(xì)胞培養(yǎng)B.1培養(yǎng)條件：37℃,含CO2濃度為5%，濕度90%環(huán)境中。B.2M199培養(yǎng)全液：89%M199培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素B.3細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)至大約80%融合時(shí)，用無(wú)菌移液管吸出培養(yǎng)基，棄掉；然后加入2mL胰蛋白酶（TE）潤(rùn)洗1次，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)基，使TE浸洗到瓶底的所有部位，大約10S后，吸出棄掉；再加入2mL胰蛋白酶，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置；約3min~5min后，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，肉眼可觀測(cè)到白色粒狀細(xì)胞脫落，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞變圓后，加入4mL的M199培養(yǎng)全液，終止消化，用移液管將細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞混懸液平均分成幾份，接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。B.4試驗(yàn)前操作：在細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，按照細(xì)胞傳代方式消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，待細(xì)胞計(jì)數(shù)完成后，計(jì)算出自己所需要的細(xì)胞液體量，按照每孔80,000個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔Transwell培養(yǎng)板上，細(xì)胞的頂側(cè)(AP)加入培養(yǎng)液0.5mL，基底側(cè)(BL)加入培養(yǎng)液1.5mL，在加入細(xì)胞液時(shí)，液體不要直對(duì)半透膜打入，否則會(huì)對(duì)半透膜造成創(chuàng)口，要對(duì)著小室的邊緣壁打入。接