1核酸檢測技術(shù)及

血站檢測核酸流程應用支持中心曲賢敏

2015年1月核酸檢測技術(shù)核酸是什么,為什么要檢測核酸是如何被檢測到的核酸檢測優(yōu)點(現(xiàn)對于ELISA)核酸檢測前提病毒是什么

1.由一種核酸分子（DNA或RNA）與蛋白質(zhì)構(gòu)成

HBVDNAHCVRNAHIVRNA 2.僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成（如朊病毒)

核酸是如何檢測的病毒核酸有病毒外殼(提取核酸)進行擴增至檢出水平(擴增)擴增時增加熒光標記(熒光定量)檢測熒光量(結(jié)果)5靈敏度HBV≤10IU/ml；HCV、HIV≤200IU/ml特異性核酸的特異性高，幾乎沒有方法學假陽性但要防止污染內(nèi)標（內(nèi)對照）為避免假陰性，要求每管陽性質(zhì)控自動化大規(guī)模、高通量核酸檢測的技術(shù)優(yōu)點靈敏度宣傳靈敏度是指單人份的檢測實際靈敏度=宣傳靈敏度*Pooling數(shù)靈敏度是IU單位,其他無可比性HCV,HIV窗口濃度高,要求靈敏度比HBV要低與取樣幾率有很大關(guān)系(低病毒濃度)內(nèi)標控制內(nèi)標的定義(InnerControl)人工合成的小段DNA片段,隨樣本一起進行提取擴增.內(nèi)標作用內(nèi)標是PCR檢測目標基因的必需成分,防止假陰性,提高檢測靈敏度的重要指示.內(nèi)標會對整個核酸檢測過程的一個監(jiān)控,包括樣本的提取,熒光擴增,及反應液的配制,PCR的抑制因素等.內(nèi)標與ELISA的陰陽性對照有區(qū)別8

病毒變異免疫靜默期實驗操作失誤病毒感染的窗口期項目ELISA窗口期項目NAAT窗口期HBsAg56HBV25抗-HCV72HCV59抗-HIV22HIV11核酸對比酶免優(yōu)點血站核酸檢測流程標本采集標本保存標本制備核酸提取核酸擴增檢測結(jié)果分析標本采集保存采血車上采血之后,立即進行冷凍離心HCV半衰期只有4小時2-8度保存上機前再次離心核酸提取

(磁珠法)樣本匯集(有/沒有)裂解結(jié)合洗滌磁珠加熱洗脫匯集什么是匯集為什么要匯集匯集的優(yōu)缺點裂解結(jié)合細胞裂解：破碎細胞膜及核膜.病毒裂解:破碎病毒外殼(蛋白質(zhì)).核酸結(jié)合:pH較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合

洗滌磁珠洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離.

干擾物通常是血液中的其他蛋白質(zhì)洗滌最后一步通常為酒精,干燥或者純水沖洗.洗脫核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來。(不完全被洗脫)洗脫液量比較少的情況下,洗脫效率會略提高.擴增檢測檢測三項(多重,單項)PCR/TMA PolymeraseChainReaction TranscriptionMediatedAmplification分析數(shù)據(jù)TMATMA與PCR比較結(jié)果判讀一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。CTCT值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)此數(shù)值由廠家經(jīng)過大量實驗測定.問題血站檢測為什么無TP?血站大部分用匯集?如何理解核酸