S中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)T魯氏耶爾森氏菌檢測(cè)技術(shù)規(guī)9發(fā) 1實(shí)中華人民共和國(guó)海關(guān)總署發(fā)布T 本文件按標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國(guó)海關(guān)總署提出并歸口。本文件起草單位中華人民共和國(guó)深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心中華人民共和國(guó)黃埔海關(guān)技術(shù)中心中華人民共和國(guó)福州海關(guān)中華人民共和國(guó)天津海關(guān)中華人民共和國(guó)武漢海關(guān)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件主要起草人王津津陳兵陳進(jìn)會(huì)吳江劉葒王乃福史秀杰于力楊俊興鄭曉聰、王武軍陳孝宇任向陽麥晨秦智鋒。ⅠT魯氏耶爾森氏菌檢測(cè)技術(shù)規(guī)范圍本文件描述了魚類魯氏耶爾森氏菌的分離培養(yǎng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和生化鑒定方法。本文件適應(yīng)于魚類魯氏耶爾森氏菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中注日期的引用文件僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改單適用于本文件。分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方出入境動(dòng)物檢疫采術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義縮略語下列縮略語適用于本文件腦心浸出液瓊脂DNA:脫氧核糖核酸脫氧核糖核苷酸三磷酸溴化乙錠m磷酸鹽緩沖液聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)胰蛋白胨大豆瓊脂。概述魯氏耶爾森氏菌屬于腸桿菌科耶爾森氏菌屬是一種能夠引起水生動(dòng)物特別是冷水魚類和溫水鯉科魚類發(fā)生腸炎紅嘴病的條件性致病菌。由該菌引起的疾病的臨床癥狀流行病學(xué)等見附錄。試劑和材料胰蛋白胨大豆瓊脂見附錄B中腦心浸出液瓊脂見1T氧化酶試劑見革蘭氏染色液見磷酸鹽緩沖液見商品化的生化鑒定試劑盒水用于包括核酸抽提DEPC處理DNARNA酶。其余用水應(yīng)符合2一級(jí)水的規(guī)格酶20℃保存避免凍融或溫度劇烈變化;;擴(kuò)增片段大小儀器和設(shè)備剪刀和鑷子培養(yǎng)皿恒溫培養(yǎng)箱普通冰箱和超低溫冰箱顯微鏡離心機(jī)和離心管微量移液器及吸頭電泳儀或全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀紫外觀察燈或凝膠成像儀全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)組織勻漿機(jī)或無菌研缽生物安全柜恒溫水浴鍋渦旋振蕩器樣品處理采樣8的規(guī)定采樣。無臨床癥狀的魚無菌采集其腎肝脾等對(duì)于體表有臨床癥狀的魚可采取其病灶深處的組織處理用于分離培養(yǎng)的樣品直接將采集的組織用無菌接種環(huán)接種培養(yǎng)基用于PCR檢測(cè)的樣品將采集的組織置于無菌離心管中加入5使用組織勻漿機(jī)充分勻漿12如無組織勻漿機(jī)則將樣品放入無菌研缽中充分研磨然后將制2T備好的組織懸液在4離心10取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌離心管中備用核酸檢測(cè)方法核酸抽提將處理好的組織樣品或者疑似為魯氏耶爾森氏菌的細(xì)菌分離物加到含有20μL蛋白K()和L緩沖液見的5L離心管中上下顛倒混勻?qū)驖{液置于56℃水浴水浴1h~3h;向勻漿液中按1∶1比例加入酚/三氯甲烷/異戊醇混合液見上下顛倒混勻g離心5轉(zhuǎn)移上層水相加入等體積三氯甲烷/異戊醇混合液見上下顛倒混勻g離心5轉(zhuǎn)移上ng上清液于沉淀中加入5%乙醇溶液輕輕混勻后離心5傾去上清液室溫晾干;用30μL滅菌雙蒸水溶DNA沉淀冰上保存?zhèn)溆?。若需長(zhǎng)期保存應(yīng)放置在-20保存。也可使用等效的商品化試劑盒抽提核酸R5LLq0LL120210延伸54℃保溫電泳用E電泳緩沖液見配制%%的瓊脂糖凝膠含L見。將凝膠放入水平電泳槽使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將L樣品和溴酚藍(lán)指示劑溶液按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)使用核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物作對(duì)照5m電泳約當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。在凝膠成像儀或紫外投射燈下觀察有無A帶并判定結(jié)果。也可使用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行電泳測(cè)序和分析對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定測(cè)序結(jié)果與k中的序列進(jìn)行比對(duì)按附錄結(jié)果判定將標(biāo)準(zhǔn)菌株的核酸設(shè)立為陽性對(duì)照空白對(duì)照陰性對(duì)照均成立視為反應(yīng)結(jié)果符合R無擴(kuò)增或擴(kuò)增片段大小不符合判定為魯氏耶爾森氏菌陰性。若擴(kuò)增處出現(xiàn)p陽性擴(kuò)增帶且擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與k中魯氏耶爾森氏菌的序列相似度%則需要按照第0章中所述進(jìn)行細(xì)菌分離和細(xì)菌初步鑒定將符合3判定的疑似魯氏耶爾森氏菌進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)菌R鑒定或生化鑒定確定。細(xì)菌分離和培養(yǎng)℃5形態(tài)為圓形隆起表面光滑邊緣整齊有光澤的乳白色半透明菌落直徑2mm~3mm。3T細(xì)菌初步鑒定革蘭氏染色將可疑菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察。如觀察到紅色短桿狀細(xì)菌表明為革蘭氏陰性菌氧化酶試驗(yàn)在一載玻片上放一塊濾紙片然后用一滴蒸餾水濕潤(rùn)紙片再用接種環(huán)取單個(gè)菌落于上述濕的紙片上最后在其上加一滴氧化酶試劑。若在12n不變色表明該菌氧化酶陰性。結(jié)果判定革蘭氏染色陰性氧化酶試驗(yàn)陰性菌體呈微彎曲的短桿狀細(xì)菌可判定為疑似魯氏耶爾森氏菌需做細(xì)菌R鑒定或生化鑒定確定。細(xì)菌分離物生化鑒定對(duì)上述疑似魯氏耶爾森氏菌進(jìn)一步做生化鑒定鑒定結(jié)果見表。也可采用商品化的生化鑒定試劑盒按其說明書要求進(jìn)行操作或采用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。表1魯氏耶爾森氏菌生化特性生化反結(jié)果生化反結(jié)果半乳糖+肌醇-精氨-山梨-賴氨酸脫羧+鼠李-鳥氨酸脫羧+蔗糖-檸檬-蜜二--苦杏仁-尿素-阿拉伯-色氨酸脫氨-氧化-吲哚產(chǎn)-硝酸鹽還-P反應(yīng)++明膠-麥康凱培養(yǎng)基生+葡萄++甘露+—綜合判定組織樣品經(jīng)PCR檢測(cè)為陽性且經(jīng)過細(xì)菌分離培養(yǎng)進(jìn)一步生化鑒定或者細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果4T為陽性的判定為魯氏耶爾森氏菌檢測(cè)陽性分離菌經(jīng)初步鑒定為疑似魯氏耶爾森氏菌經(jīng)進(jìn)一步生化鑒定或者細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果為陽性的判定為魯氏耶爾森氏菌檢測(cè)陽性。組織樣品經(jīng)PCR檢測(cè)為陰性或未分離到細(xì)菌或所分離到細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果不符合魯氏耶爾森氏菌特性的均判定為魯氏耶爾森氏菌陰性。5T附錄資料性魯氏耶爾森氏菌簡(jiǎn)病原魯氏耶爾森氏菌是革蘭氏陰性腸桿菌該菌為微彎曲大小在×的桿菌靠7根~8根周鞭毛運(yùn)動(dòng)5℃培養(yǎng)有動(dòng)力7℃培養(yǎng)無動(dòng)力。在胰蛋白胨大豆瓊脂或腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)48h~72h可形成圓形隆起表面光滑邊緣整齊有光澤的乳白色半透明菌落直徑2mm~3mm。危害6年首次報(bào)道該病原菌分離自美國(guó)愛達(dá)荷州哈格曼山谷的患病虹鱒s。目前在北美洲南美洲歐洲澳大利亞南非中東地區(qū)和中國(guó)等地都有報(bào)道。魯氏耶爾森氏菌可感染多種魚類對(duì)鮭科魚類影響特別明顯是造成鮭科魚類腸炎紅嘴病M的主要病原菌。臨床癥狀被感染的魚可以觀察到異常的行為變化包括在水面附近游動(dòng)食欲不振和異常游動(dòng)如豎游旋游倒游等患病魚還表現(xiàn)出其他體征如眼球突出皮膚變黑口腔和咽喉及其周圍皮下出血肛門紅腫有異物流出等。魯氏耶爾森氏菌侵染初期出現(xiàn)患病典型癥狀的魚較少感染后短時(shí)間內(nèi)疾病大規(guī)模暴發(fā)死亡嚴(yán)重。地理分布在北美洲南美洲歐洲澳大利亞南非中東地區(qū)和中國(guó)等地均有分布易感宿主魯氏耶爾森氏菌可感染多種魚類鮭科魚類影響特別明顯。除了鮭魚以外鰻魚a-鯉魚鱘魚鯰魚s等也能被感染。6T附錄B規(guī)范性)試劑配制胰蛋白胨大豆瓊脂胰蛋白胨大豆瓊 蒸餾 0溶解胰蛋白胨大豆瓊脂到蒸餾水中1高壓滅菌5水浴冷卻50℃倒成平板大約厚4保存腦心浸出液瓊脂腦心浸出液瓊 蒸餾 0溶解腦心浸出液瓊脂到蒸餾水中1℃高壓滅菌15水浴冷卻50,倒成平板大約3厚4保存氧化酶試劑四甲基對(duì)苯二 蒸餾 0將四甲基對(duì)苯二胺溶于蒸餾水中2℃~5℃冰箱避光保存在7d內(nèi)使用注:也能使用等效的商品化的氧化酶試紙條革蘭氏染色結(jié)晶紫染色液結(jié)晶 % 01%草酸銨水溶 0將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中然后與草酸銨溶液混合革蘭氏碘液 碘化 蒸餾 0將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合加入蒸餾水少許充分振搖待完全溶解后再加蒸餾水至mL沙黃復(fù)染液沙 % 0蒸餾 0將沙黃溶解于乙醇中然后用蒸餾水稀釋7T染色法涂片用火焰固定后滴加結(jié)晶紫染液作用1水洗。滴加革蘭氏碘液作用1水洗。滴加5%乙醇脫色直至染色液被洗掉不要過分脫色水洗。滴加復(fù)染液復(fù)染1水洗待干鏡檢。磷酸鹽緩沖液氯化 氯化 磷酸氫二 磷酸二氫 無e超純 將固體物質(zhì)溶解于水如果有必要5℃時(shí)調(diào)節(jié)pH至1℃高壓滅菌15冷卻備用 蛋白酶工作液)E 0mL 10g0L的工作液消化緩沖液L0LH1LH%質(zhì)量