生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告實(shí)驗(yàn)四麥清蛋白的初步提取一、研究背景無論是在科學(xué)研究還是商業(yè)化產(chǎn)品的開發(fā)中，生物大分子的分離純化似乎都是一個(gè)永恒的話題。針對某一類物質(zhì)的分離，人們通過尋求它們之間的共性特征而發(fā)明并利用了諸多的分離純化技術(shù)。然而隨著人們對某一特定目標(biāo)產(chǎn)物活性與純度的需求逐漸增大，而同類物質(zhì)之間彼此性質(zhì)的相似性使得精確的分級難度隨之加大，二者之間的矛盾刺激人們不斷探索新的技術(shù)以提高純化水平。與此同時(shí)，人們也開始將注意力從共性轉(zhuǎn)移到目標(biāo)物自身的獨(dú)特性質(zhì)上來，導(dǎo)致了眾多分離純化新技術(shù)的產(chǎn)生與應(yīng)用。在所有的分離純化技術(shù)中，層析技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢始終占據(jù)著生物大分子純化的主導(dǎo)地位。層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)，從本質(zhì)上來講它就是將目標(biāo)分離產(chǎn)物與雜質(zhì)的顯著差異轉(zhuǎn)化為遷移距離上的差異，從而達(dá)到分離提取的目的。層析法具有明顯的優(yōu)勢：（1）從理論上來講，只要遷移距離足夠長，任何物質(zhì)都可以從其所在的混合體系中被分離出來；（2）除了定性能力較差以外，層析法幾乎囊括了物質(zhì)分析純化中的所有優(yōu)點(diǎn)，比如分離效率高、速度快，樣品用量少、檢測靈敏度高、分析速度快、易于自動(dòng)化管理等；（3）基于不同的原理，層析法衍生出諸多的操作技術(shù)，在實(shí)際應(yīng)用中可以根據(jù)待分離物質(zhì)的特定性質(zhì)選擇適合的操作技術(shù)?；谝陨显颍瑢游龇ㄔ诜蛛x高純度、高活性的生物大分子中有著不可替代的作用。二、研究目標(biāo)1.以凝膠過濾層析法完成麥清蛋白的脫鹽以驗(yàn)證該技術(shù)的可行性；2.掌握層析技術(shù)的基本操作技巧；3.體會相關(guān)技術(shù)的發(fā)明思路和歷程，領(lǐng)悟新技術(shù)的發(fā)明對邊緣性實(shí)驗(yàn)學(xué)科的重要作用。三、研究策略凝膠過濾層析是生化分離常用色譜技術(shù)的一種，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用,根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行分離，也被稱為體積排阻層析（SizeExclusionChromatography）、分子篩層析（MolecularSieveChromatography）或凝膠滲透層析（GelPermeationChromatography）。凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個(gè)顆粒猶如一個(gè)篩子。當(dāng)樣品溶液通過凝膠柱時(shí)，相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動(dòng)，首先流出層析柱；相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)可自由地進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，使流量增長，移動(dòng)速率慢而最后流出層析柱；中等大小的分子在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫。這樣，由于分子量大小不同的物質(zhì)被洗脫的時(shí)間是一定的，經(jīng)過層析柱后，混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離。在凝膠過濾層析中，選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果最根本的保證。蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質(zhì)以及一些注射劑去除大分子熱源物質(zhì)等等，一般常用排阻極限較小的凝膠類型。選擇時(shí)要依據(jù)分離的具體情況而定，例如樣品中各個(gè)組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達(dá)到分離的目的；如果有個(gè)別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。四、研究方案及可行性分析本次實(shí)驗(yàn)我們以新鮮的小麥種子為材料，分離純化麥清蛋白。（1）使用硫酸銨的中性鹽沉淀法對麥清蛋白進(jìn)行粗分離，分離后的蛋白質(zhì)中含有無機(jī)鹽等小分子雜質(zhì)。（2）采用凝膠過濾層析法脫鹽，連續(xù)收集洗脫液。（3）用紫外分光光度計(jì)測定各階段收集液的OD280值以檢測蛋白含量，確定蛋白質(zhì)峰值管并保存（后續(xù)的實(shí)驗(yàn)六中SDS測定分子量及純化效果）。（4）采用比濁法以BaCl2檢測純化產(chǎn)物中硫酸根離子的存在情況從而判斷凝膠過濾層析的脫鹽效果。實(shí)驗(yàn)方案合理，簡便易行，實(shí)驗(yàn)材料及器具基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室均可提供，時(shí)間上也允許，故本方案具有較高的可行性。五、具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.實(shí)驗(yàn)儀器及試劑儀器：離心機(jī)、托盤天平、紫外分光光度計(jì)、層析柱、恒流泵、部分收集器；；器具：微量可調(diào)手動(dòng)移液器、研缽；試劑：飽和（NH4）2SO4溶液、1%的BaCl2溶液、洗脫液、蒸餾水；材料：新鮮小麥種子、葡聚糖凝膠G-25。

2.實(shí)驗(yàn)步驟（1）溶脹凝膠（教師完成）稱取適量葡聚糖凝膠G-25→加入足量蒸餾水或洗脫液→沸水浴溶脹5h→攪拌使其懸浮→靜置，使大部分凝膠沉降→用傾斜法除去含細(xì)碎顆粒的上層液→反復(fù)多次，直至無細(xì)顆粒為止→將凝膠在真空干燥器中減壓除氣，準(zhǔn)備裝柱（2）裝柱（3.5h）層析柱下端止水→裝入約1/4柱長的洗脫液→倒入凝膠，開啟洗脫→裝柱至3/4左右，注意使柱中凝膠一直處在溶液中（注意裝柱完成后層析柱下端需適時(shí)止水以保證洗脫液面高于凝膠頁面3~5cm）→凝膠沉降完成，旋上柱帽并連接洗脫系統(tǒng)，平衡洗脫3h→連接恒流泵和收集檢測系統(tǒng)，調(diào)節(jié)好流速和收集系統(tǒng)以備下用（控制流速為每滴10秒，收集量為每管3毫升）（3）鹽析法分離提取麥清蛋白（2h）粉碎2g小麥種子→置于三角瓶中，加20ml蒸餾水→連續(xù)震蕩0.5h，再間歇震蕩0.5h→3000r/min離心20min，取上清液（澄清透明，否則再過濾）→用醋酸調(diào)pH至4.7→邊攪拌邊加入等體積的飽和硫酸銨溶液，有白色絮狀沉淀產(chǎn)生，冰箱冷藏室過夜→3000r/min離心20min，棄上清液，加2ml去離子水充分溶解沉淀，得混合液，準(zhǔn)備上樣脫鹽。（4）上樣（1h）在柱內(nèi)放入濾紙片→用恒流泵加速按鈕使洗脫液面和膠床表面相齊，停止洗脫→將1ml樣品提取液注入凝膠床面中央，開啟洗脫和收集器收集→待樣液與凝膠床面相齊時(shí)用滴管加入略高于剛才上樣高度的洗脫液（重復(fù)兩次）→用滴管加入3~5厘米高的洗脫液層→戴上柱帽，連續(xù)洗脫收集（5）洗脫、收集和鑒定（1.5h）每3ml收集一管→用紫外分光光度計(jì)在280nm處測消光值→以管號為橫坐標(biāo)，消光值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，確定蛋白峰值管（保留蛋白峰值管，實(shí)驗(yàn)六SDS測定其分子量并檢測純化效果）→分別向各管加入兩滴1%的BaCl2溶液（蛋白峰值管中不要加入BaCl2），比濁法比較脫鹽效果。（6）原始數(shù)據(jù)記錄處管號1234567OD280管號891011121314OD280管號15161718192021OD2803.實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間預(yù)計(jì)本實(shí)驗(yàn)共需時(shí)間約8h。4.誤差分析（1）裝柱時(shí)應(yīng)保證層析柱的均一性，否則會嚴(yán)重影響分離的結(jié)果。合格的凝膠柱應(yīng)該上下均一，無界面、氣泡和裂隙。（2）實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制流速（6滴/分）與收集量（3毫升/管）。（3）調(diào)等電點(diǎn)（pH4.7）時(shí)應(yīng)該嚴(yán)格控制pH，保證麥清蛋白能夠充分沉淀。（4）上樣洗脫時(shí)加入洗脫液的體積要略高于（過高會使樣品稀釋，影響分離效果）上樣高度，以便將殘留在柱子內(nèi)壁上的樣品集中洗入膠柱（避免樣品損失）。六、質(zhì)疑及相關(guān)思考1.鹽析后含有蛋白質(zhì)沉淀的體系需要在冰箱內(nèi)冷藏過夜，本實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間的限制這一點(diǎn)顯然無法做到，因此需要縮短時(shí)間。2.本實(shí)驗(yàn)在加入中性鹽硫酸銨之前需調(diào)節(jié)pH4.7，而在實(shí)驗(yàn)三已經(jīng)了解到實(shí)驗(yàn)室并未配備pH計(jì)，但僅靠pH試紙無法達(dá)到如此高的精確度。另外了解到麥清蛋白的等電點(diǎn)為4.5~4.7，故個(gè)人建議在保留使用pH試紙的條件下調(diào)節(jié)pH4.5。3.層析柱的大小、長短也會對分離結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，本實(shí)驗(yàn)是如何選擇與考慮的？七、思考題1.生物大分子有哪些可利用的性質(zhì)來完成其自身的純化？（1）利用酸堿性質(zhì)與等電點(diǎn)的差異，如等電沉淀、等電聚焦電泳等；（2）利用電荷性質(zhì)，如電泳、離子交換柱層析；（3）利用溶解度差異，如鹽溶與鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、變性沉淀等；（4）利用分子大小與形狀差異，如透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾層析等；（5）利用吸附特性，如吸附層析；（6）利用特異性親和力，如親和層析。2以至少兩種純化生物大分子的層析技術(shù)為例，探討它的發(fā)明思路。（1）凝膠過濾層析：在蛋白質(zhì)的粗分級中常用的分離手段是中性鹽沉淀以及等電點(diǎn)沉淀，而兩種方法所面臨的一個(gè)問題就是如何除去粗分離后蛋白質(zhì)中殘留的無機(jī)小分子。透析法的出現(xiàn)基本上解決了這個(gè)問題，但是操作十分繁瑣，不僅需要多次更換大量的透析液，同時(shí)不斷的攪拌經(jīng)常會破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，且最終小分子雜質(zhì)的去除并不徹底；隨后人們對透析法稍作改進(jìn)便發(fā)明了超濾法，使得操作過程簡便了許多，該法通過加壓、離心等處理方式，使水分子穿過半透膜快速離開而大分子蛋白質(zhì)被截留濃縮，在此過程中同樣會產(chǎn)生較強(qiáng)的機(jī)械力，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞在所難免，最終其活性回收率并不高。因此，人們迫切需要一種簡便、快速且蛋白質(zhì)活性回收率高的脫鹽手段。就在這時(shí)，尺寸排阻效應(yīng)的理論基礎(chǔ)已經(jīng)建立，且蛋白質(zhì)等生物大分子與無機(jī)小分子具有顯著的大小差異，凝膠過濾層析法便應(yīng)運(yùn)而生。隨后，在該技術(shù)的應(yīng)用過程中，人們也用它來分離相對分子質(zhì)量相差較大的生物大分子、溶液濃縮及分子量測定等。（2）親和層析：進(jìn)行生物大分子的分離純化就是要除雜，因此人們利用它們各種各樣的特性來發(fā)明了諸多的分離純化技術(shù)。但是，當(dāng)混合體系中存在與我們所要分離的目標(biāo)物性質(zhì)十分相似的生物大分子雜質(zhì)時(shí)，一些方法就顯得蒼白無力。以蛋白質(zhì)為例，我們要從體系中分離出一種目標(biāo)蛋白，而雜質(zhì)中偏偏存在與該蛋白酸堿性、電荷性質(zhì)、分子大小和形狀、溶解度等諸多性質(zhì)非常相似的物質(zhì)，普通方法卻無法將該雜質(zhì)除去。此外，在分離純化目標(biāo)物時(shí)，其活性與純度往往是比較看重的一個(gè)因素，而一些方法往往是顧此失彼。這時(shí)人們就將注意力從尋找共性轉(zhuǎn)移到尋找目標(biāo)物的特性上，而目標(biāo)物本身就存在可與某些特異性配基專一、可逆性結(jié)合的特性，如酶與基質(zhì)（或抑制劑）、抗原與抗體、激素與受體、外源凝集素與多糖類、核蛋白與核酸等之間均存在專一的相互作用。再加上色譜法的在生物大分子的分離純化中廣泛應(yīng)用，人們自然想到使這些相互作用物質(zhì)其中一方與不溶性擔(dān)體（如葡聚糖等惰性凝膠）形成共價(jià)結(jié)合化合物，用來作為層析介質(zhì)，當(dāng)含有目標(biāo)物（另一方）的混合物流經(jīng)該介質(zhì)時(shí)就能與配體特異性結(jié)合，用特定的洗脫液洗脫便可除去目標(biāo)物以外的雜質(zhì)，最后改變洗脫條件使目標(biāo)物從配體上分離，達(dá)到了純化的目的。快速、高效，目標(biāo)物純度高、活性好，親和層析法就這樣產(chǎn)生應(yīng)用到了生物學(xué)研究中。3.試著探討一下一項(xiàng)新技術(shù)發(fā)明的思維及實(shí)施過程。一項(xiàng)新技術(shù)的發(fā)明大概需要以下幾步：（1）原有技術(shù)在某個(gè)方面明顯表現(xiàn)出不足，而人們在研究過程中卻需要用到這方面的特性，落后的技術(shù)不能滿足科技的發(fā)展需求，二者之間產(chǎn)生矛盾，這樣就會刺激人們?nèi)ヌ綄ば碌募夹g(shù)來解決這一問題；（2）在發(fā)明新技術(shù)時(shí)，首先要對需要達(dá)到的目標(biāo)有一個(gè)定位，然后在當(dāng)前已經(jīng)建立的知識體系中找出可能實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的理論基礎(chǔ)；（3）隨后將理論基礎(chǔ)經(jīng)過加工改造而設(shè)計(jì)出新的技術(shù)，這應(yīng)該是比較難也是很耗費(fèi)時(shí)間的一步，是新技術(shù)產(chǎn)生的核心；（4）新技術(shù)在大規(guī)模投入使用之前（實(shí)驗(yàn)室階段）需要對其進(jìn)行檢驗(yàn)，一來確定是否達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，二來檢測技術(shù)本身的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性等是否符合要求；（5）在檢測其合格之后，新技術(shù)開始大范圍使用；（6）在實(shí)際使用的過程中，可能會遇到一些小問題，需要對技術(shù)進(jìn)行調(diào)整與改進(jìn)使其逐步趨于完善。4.中性鹽沉淀中硫銨分級沉淀是蛋白質(zhì)粗分級中最常用的手段，為什么？中性鹽沉淀的原理是大量中性鹽加入使水活度降低，它們在爭奪溶劑水的同時(shí)破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，使疏水氨基酸暴露，從而發(fā)生聚集沉淀下來。不同蛋白質(zhì)分子表面的疏水氨基酸含量不同，溶解度也存在差異，因而沉淀所需中性鹽濃度也不一致。因此使用特定濃度的中性鹽可使目標(biāo)蛋白從混合體系中得到初級分離。硫酸銨分級沉淀之所以被常用于蛋白質(zhì)的粗分級，原因是：（1）硫酸銨屬于惰性物質(zhì)，不易與其他生物活性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，在純化過程中能最大程度的保護(hù)蛋白質(zhì)活性，不易使蛋白質(zhì)變性；（2）硫酸銨為二價(jià)離子，等濃度時(shí)離子強(qiáng)度高，能更有效的降低蛋白質(zhì)溶解度；（3）硫酸銨在水中的溶解度大、溫度系數(shù)小，在低溫時(shí)仍可以高濃度存在，既能夠滿足低溫沉淀某些蛋白質(zhì)的需要，又能有效爭奪溶劑水和破壞蛋白質(zhì)水化層，使蛋白質(zhì)有效沉淀；（4）硫酸銨溶解性好也為后續(xù)的高鹽純化做準(zhǔn)備，便于洗滌去除。5.本次實(shí)驗(yàn)中，洗脫液應(yīng)該是什么？選擇的依據(jù)是什么？選擇洗脫液時(shí)應(yīng)該考慮以下幾點(diǎn)：（1）由于分離目標(biāo)物為蛋白質(zhì)，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，故洗脫液應(yīng)該具有一定的pH且原則上應(yīng)遠(yuǎn)離目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)，避免蛋白質(zhì)沉淀堵塞層析柱，影響分離效果；（2）對于分子量較大的物質(zhì)，溶液的粘度隨濃度（一般不超過4%）增加而增大，會使分子運(yùn)動(dòng)受限，故洗脫液與樣品的相對粘度不得超過1.5-2；（3）洗脫液應(yīng)與溶脹劑一致，否則改換溶劑會使凝膠體積產(chǎn)生改變，影響分離效果；（4）要考慮填料對分離物的吸附作用，本實(shí)驗(yàn)填料為交聯(lián)葡聚糖凝膠，它為弱酸性物質(zhì)，