植物葉綠素的定量測定一，植物葉綠素定量測定的意義葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，是一類含脂的色素家族，位于類囊體膜。葉綠素吸收大部分的紅光和紫光，但反射綠光，所以葉綠素呈現(xiàn)綠色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。葉綠素為鎂卟啉化合物，包括葉綠素a、b、c、d、f以及原葉綠素和細(xì)菌葉綠素等。葉綠素不很穩(wěn)定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解。酸性條件下，葉綠素分子很容易失去卟啉環(huán)中的鎂成為去鎂葉綠素。葉綠素有造血、提供維生素、解毒、抗病等多種用途。定量葉綠素的測定可以了解植物物質(zhì)轉(zhuǎn)化的程度和速度。二，植物葉綠素定量測定原理根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長下測定其消光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的消光度D與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即：D=klc（k為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，k為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的比吸收系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的消光度而求得。）如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總消光度等于各組分在相應(yīng)波長下的總和，這就是消光度的加和性。今欲測定葉綠素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素在該波長下的比吸收系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡羅卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液（注：丙酮有毒，可用下文闡述的酒精代替。）在紅光區(qū)的最大吸收峰分別是663nm和645nm，又知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數(shù)分別是82.04和9.27，在波長645nm下分別16.75和45.6，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：D663=82.04Ca+9.27CbD645=16.75Ca+45.60Cb(上式中D663、D645表示葉綠素溶液在波長663nm和645nm時的消光度；Ca、Cb葉綠素a、b濃度（mg/L）)由上兩式組成方程組解得：Ca=12.72D663-2.59D645Cb=22.88D645-4.67D663將Ca、Cb相加即得葉綠素總量CTCT=Ca+Cb=20.29D645+8.05D663另外，由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的比吸光系數(shù)（均為34.5），也可以在此波長下測定一次消光度（D652）而求出葉綠素a、b總量：CT=（D532×1000）/34.5在葉綠素存在的條件下，用分光光度計法可同時測定出溶液中的類胡羅卜素的含量。Lichtenthaler等對Arnon法進行了修正，提出了80%的丙酮提取液中3中色素含量的計算公式：Ca=12.21D663-2.81D646Cb=20.13D646-5.03D663Cx·c=（1000D470-3.27Ca-104Cb）/229(式中Ca、Cb葉綠素a、b濃度mg/L；Cx·c類胡蘿卜素的總濃度；D663、D646和D470表示葉綠素溶液在波長663nm、646nm和470nm下的消光度)由于葉綠素在不同溶劑中的吸光光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時，計算公式也有所不同。葉綠素a、b在96%的乙醇中的最大吸收峰的波長分別是665nm和649nm，類胡羅卜素為470nm（95%乙醇：純丙酮=1:1（v/v）的混合提取液中的最大吸收峰波長為663nm、646nm和470nm），可據(jù)此列出以下關(guān)系式：Ca=13.95D663-6.88D646Cb=24.96D646-7.32D663Cx·c=（1000D470-2.05Ca-114.8Cb）/245該公式應(yīng)是96%乙醇提取液的計算公式三，儀器與用具722分光光度計（或紫外分光光度計可直接程序測試三個值）；剪刀；25ml棕色容量瓶；小漏斗；7cm直徑定量濾紙；吸水紙；擦鏡紙（可用衛(wèi)生紙代替）；滴管；電子天平（精確到0.01g）；稱量紙。四，試劑提取液：1.96%乙醇（或80%的丙酮，下同）（用純凈水與純酒精或丙酮配制）（供方法1）2.95%乙醇：純丙酮=1:1（v/v）（供方法2，混合提取液效果好一些，但是丙酮有毒）注：以上兩種提取液均可提取葉綠素，各自優(yōu)缺點如上所述，但二者比色時的波長不同。五，方法與步驟1，

取鮮葉（或從冰箱里拿出來的葉子）去掉葉脈，截取葉片中段，擦凈組織表面污物，并吸干葉片表面附著水。（注意：因為葉綠素遇光易分解，所以取下的葉子及整個流程都應(yīng)該采取避光處理），準(zhǔn)確稱取0.2g鮮樣3份分別置于3個50ml帶刻度的離心管中。（按Lichtenthaler等（1983）修正的Arnon法（1949）進行葉綠素（Chl）和類胡蘿卜素（Car）含量測定。）2，

吸取10ml提取液置于離心管中，密封并置于30～40℃溫箱中（盡量按照條件做，實在達不到的延長提取時間至72小時），此過程中需輕搖幾次。當(dāng)葉片完全變白時即可比色。3，

比色時，以提取液為空白，在波長663nm、646nm和470nm下測定吸光度；每樣重復(fù)測定2次。附，1，分光光度計的使用方法1.1

接通電源，打開儀器開關(guān)，掀開樣品室暗箱蓋（必須地啊?。?，預(yù)熱30分鐘。1.2

將靈敏度開關(guān)調(diào)至“1”檔（若零點調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0”時，需選用較高檔。）1.3

根據(jù)所需波長轉(zhuǎn)動波長選擇鈕，選擇需要的波長值。1.4

調(diào)零調(diào)百。將空白液分別倒入比色皿3/4處，用擦鏡紙（或高級衛(wèi)生紙）擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，使空白管對準(zhǔn)光路，調(diào)零調(diào)百——在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤指針指向t=0處，.蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)“100”調(diào)節(jié)器，使空白管的t=100，指針穩(wěn)定后測量樣品液。1.5

測量完后，關(guān)閉機器，樣品室用軟布或軟紙擦凈，注意儀器保養(yǎng)。注意：1.定量分析的時候要注意樣品線性的濃度范圍，如果濃度太高或者太低都會影響到數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。2.對光敏感的樣品液，如酶類，測量時要注意迅速有效。六，結(jié)果計算1，提取液為酒精時的計算方法：Ca=13.95D663-6.88D646Cb=24.96D646-7.32D663Cx·c=（1000D470-2.05Ca-114.8Cb）/245三種色素的濃度和即為葉綠素濃度。2，提取液為混合液時的計算方法：按Inskeep公式計算各光合色素含量：

Ca葉綠素a（mg?g-1）=

（12.21D663-2.81D646）V/1000W

Cb葉綠素b（mg?g-1）=

（20.13D646-5.03D663）V/1000W

Cx類胡蘿卜素（mg?g-1）=

(1000D470-3.27Ca-104Cb)V/1000W

式中：V為提取液體積(ml)，W為材料重（g）。六，實驗結(jié)果偏離的原因分析及其注意事項1，

葉綠素遇光易分解，所以取樣后一直實驗到最后都應(yīng)該注意遮光處理。2，

葉綠素提取時，應(yīng)該葉片應(yīng)剪成1mm寬的條狀，太大了不易提取，太小了在裁剪過程中容易損失。方法附屬說明：截取葉片中段，擦凈組織表面污物，并吸干葉片表面附著水。去葉脈，剪碎，混勻。

按Lichtenthaler等（1983）修正的Arnon法（1949）進行葉綠素（Chl）和類胡蘿卜素（Car）含量測定。

方法：將待測葉片剪碎，裝入具塞刻度試管中，加入95%乙醇：純丙酮混合液（1：1體積混合）10ml，使葉片完全浸入液體中，加蓋。置于30～40℃溫箱中（盡量按照條件做，實在達不到的話延長提取時間至72小時），此過程中需輕搖幾次。當(dāng)葉片完全變白時即可比色。

測定其光合色素的含量。比色時，以提取液為空白，在波長663nm、646nm和470nm下測定吸光度；每樣重復(fù)測定2次。

按Inskeep公式計算