2022人羊水干細(xì)胞研究進(jìn)展干細(xì)胞一直是生物學(xué)界和醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。根據(jù)來源不同，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcel，ESC)和成體干細(xì)胞，這2種細(xì)胞各有優(yōu)勢與局限性。近年來發(fā)現(xiàn)的介于兩者之間的羊水干細(xì)胞(amnioticfluid-derivedstemcellAFSC)，以其特有的優(yōu)勢成為一種新的干細(xì)胞來源。AFSC從產(chǎn)前診斷時羊膜腔穿刺所得標(biāo)本中獲得，取材方便，避免了倫理的限制，且無致瘤性。AFSC具有向外、中、內(nèi)胚層細(xì)胞分化的潛能，可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)、肌肉、心、血管、皮膚等組織，為疾病治療和基因治療的研究提供新的干細(xì)胞來源。本文將簡要介紹ESC和成體干細(xì)胞的特點(diǎn)以及AFSC的發(fā)展歷程，討論AFSC的生物學(xué)特性，并闡述其在疾病治療方面的進(jìn)展。一、ESC和成體干細(xì)胞的優(yōu)勢與局限性干細(xì)胞是一類能夠自我復(fù)制、具有多向分化潛能的細(xì)胞。干細(xì)胞可從多種組織中獲取，比如骨髓、脂肪組織、臍帶、胎盤、胚胎肝臟等。根據(jù)來源不同，干細(xì)胞可分為ESC和成體干細(xì)胞°ESC是從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到的，可分化為3個胚層的細(xì)胞，但因具有異體免疫排斥、移植后畸胎瘤形成以及倫理等問題限制了其應(yīng)用。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentialcelliPSC)是一種ESC樣的多能干細(xì)胞，于26年首次報道［1］。該研究通過轉(zhuǎn)導(dǎo)4種轉(zhuǎn)錄因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4)成功將鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞，且證實(shí)iPSC的生物學(xué)特性與ESC類似［1］。27年，這一研究團(tuán)隊(duì)在體外又成功誘導(dǎo)出人iPSC［2］。其后，又有多個研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒載體、多順反子載體轉(zhuǎn)導(dǎo)4種轉(zhuǎn)錄因子或用不含病毒載體成功誘導(dǎo)出iPSC。iPSC解決了免疫排斥與倫理的問題，但由于其技術(shù)要求高、效率低，同時用病毒作為載體，其應(yīng)用的安全性不明確。盡管非病毒載體已成功應(yīng)用于成人體細(xì)胞的誘導(dǎo)，但是產(chǎn)生iPSC的效率并不高。成體干細(xì)胞主要有間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell,MSC)、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、腸干細(xì)胞等，具有多潛能性，易于從組織中獲取，但是從多種組織中分離及體外擴(kuò)增較困難，且只能分化為特定的組織，使得其應(yīng)用受到限制。因此，干細(xì)胞研究需要尋找一種不受以上限制的新型干細(xì)胞來源。AFSC作為一種新型干細(xì)胞來源，不僅解決了ESC異體免疫排斥、移植后畸胎瘤形成以及倫理等問題，而且取材方便，易于分離，具有分化為內(nèi)、中、外3個胚層的潛能，是介于成體干細(xì)胞和ESC之間的良好種子細(xì)胞。二、AFSC的發(fā)展1993年，Torricell等［3］在妊娠12周孕婦羊水中發(fā)現(xiàn)一種細(xì)胞，呈圓形、核小，類似于造血祖細(xì)胞。隨后的研究于22年在妊娠14周孕婦羊水中分離出能表達(dá)Oct4、波形蛋白和堿性磷酸酶的多能細(xì)胞群，首次證實(shí)了羊水中存在多能干細(xì)胞［4］。Oct4是轉(zhuǎn)錄因子POU(Pit-Oct-Unc)家族的一員，在維持干細(xì)胞多能性中發(fā)揮重要調(diào)控作用。23年，有研究從羊水中分離到具有多譜系分化潛能的MSC,這些細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖能力，能夠分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和神經(jīng)元，可陽性表達(dá)MSC表面標(biāo)記物如CD90、CD105、CD73和CD166，但不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物如CD45、CD34和CD14［5］。27年有研究利用免疫磁珠技術(shù)分選出c-kit(CD117)陽性的AFSC，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)這些細(xì)胞不需要飼養(yǎng)細(xì)胞，長期培養(yǎng)沒有畸胎瘤形成，即使倍增250代仍保持正常核型和端粒酶活性，并檢測到這些細(xì)胞表面能表達(dá)ESC和成體干細(xì)胞表面標(biāo)記物［6］。隨后大量研究證明了AFSC的多向分化潛能，在體外不同培養(yǎng)環(huán)境下可被誘導(dǎo)分化為內(nèi)、中、外3個胚層的細(xì)胞類型，而且分化后的細(xì)胞保持穩(wěn)定的生物學(xué)特性，且具有相應(yīng)類型細(xì)胞的特異性功能。羊水中主要有3種干細(xì)胞：羊膜上皮干細(xì)胞、羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和AFSC，其中羊膜上皮干細(xì)胞來源于羊膜上皮層，羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源于羊膜成纖維細(xì)胞層，而AFSC可能來源于胎兒的皮膚、消化道、呼吸道和泌尿道等組織和羊膜［7］。這些細(xì)胞可通過不同的選擇性分離方法，細(xì)胞的形態(tài)和生長特點(diǎn)以及細(xì)胞標(biāo)記物加以區(qū)分［8］。三、AFSC的分離與培養(yǎng)原代羊水細(xì)胞包括2種細(xì)胞群：貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞，通過貼壁細(xì)胞對培養(yǎng)基的黏附作用可對羊水細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)。妊娠中期行產(chǎn)前診斷的孕婦，通過超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺獲取少量羊水，室溫離心，制成細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)基后，在37C、5%CO2的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)70%~80%融合時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。常用的培養(yǎng)基為含有胎牛血清、ChangB、ChangC、谷氨酰胺及抗生素等的a-MEM培養(yǎng)基。也可采用CD117免疫磁珠或流式細(xì)胞儀分離出CD117+-AFSC［6］，分離出的AFSC可以在無飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)基中良好生長。四、AFSC的生物學(xué)特性形態(tài)學(xué)：不同培養(yǎng)時間AFSC的形態(tài)與生長狀態(tài)不同。原代培養(yǎng)7d細(xì)胞貼壁形成細(xì)胞克隆，這些細(xì)胞克隆根據(jù)形態(tài)可分為上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞。上皮樣細(xì)胞較大，呈多角形，細(xì)胞間緊密連接，而成纖維樣細(xì)胞呈梭形，隨著培養(yǎng)時間的延長，成纖維樣細(xì)胞成為主要的細(xì)胞克?。?］。也有研究發(fā)現(xiàn)，分離的AFSC在培養(yǎng)初期，細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)可呈上皮樣、成纖維樣、圓形等，隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸形成梭形細(xì)胞為主的細(xì)胞克隆，存在少數(shù)類似成纖維細(xì)胞的集落和多角形鋪路石樣上皮細(xì)胞樣集落，連續(xù)進(jìn)行多次傳代后，可以發(fā)現(xiàn)上皮樣細(xì)胞明顯減少，最后基本消失，形成形態(tài)均一的梭形細(xì)胞［10］。干性：AFSC可表達(dá)MSC及ESC的部分表面標(biāo)記物及基因產(chǎn)物，是處于MSC和ESC中間階段的干細(xì)胞°AFSC可表達(dá)多潛能性標(biāo)記物如Oct4、SSEA3、SSEA4、NANOG、KLF4、MYC、TRA1-60和TRA1-81［11-12］。早在22年就有研究發(fā)現(xiàn)AFSC可表達(dá)ESC特異性基因產(chǎn)物Oct4［4］，隨后被大量研究證實(shí)。Oct4在干性調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，當(dāng)細(xì)胞分化時其水平下調(diào)。但是關(guān)于Oct4是否在調(diào)控干細(xì)胞增殖與分化中起關(guān)鍵作用一直備受爭議［13］。AFSC還可表達(dá)MSC的表面標(biāo)記物CD90、CD105、CD73、CD44和CD29，而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物如CD45、CD34、CD133,也不表達(dá)組織相容性復(fù)合體II、CD40、CD80、CD86［14］。最近一項(xiàng)研究顯示，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，CD105的表達(dá)增多［9］。由于CD105是一種MSC表面標(biāo)記物，長期的培養(yǎng)可能更有利于細(xì)胞向MSC方向分化。盡管已有大量研究證實(shí)了這些標(biāo)記物在AFSC的表達(dá)，但是不同文獻(xiàn)所報道的標(biāo)記物和其陽性表達(dá)率不盡相同，這可能是由于分離方法和培養(yǎng)條件不同，或者是取自不同胎齡和不同個體的標(biāo)本中AFSC本身的異質(zhì)性所致。探尋特異性的標(biāo)記物，建立統(tǒng)一的分離純化標(biāo)準(zhǔn)將有助于AFSC的鑒定?？烧T導(dǎo)性：羊水細(xì)胞可像成人體細(xì)胞一樣誘導(dǎo)為iPSC，且其誘導(dǎo)出的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和標(biāo)記物表達(dá)上具有與ESC及成人體細(xì)胞誘導(dǎo)的iPSC相似的特點(diǎn)，且其誘導(dǎo)更為高效［15］。然而，此研究只對羊水中終末分化細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。直到2012年，Moschidou等［11］首次應(yīng)用丙戊酸實(shí)現(xiàn)對AFSC的重編程，該研究將c-kit+-AFSC與含有丙戊酸的ESC混合培養(yǎng)從而獲得重編程的AFSC，這些細(xì)胞可在體內(nèi)或體外形成胚體，即使長期培養(yǎng)，仍具有良好的遺傳穩(wěn)定性和生長動力學(xué)，并可向內(nèi)、外、中3個胚層分化。但是對于AFSC的誘導(dǎo)機(jī)制仍不清楚。端粒酶活性：端粒酶是一種能保持染色體末端端粒長度的酶，可以使染色體末端免受破壞或與鄰近染色體融合。因人類體細(xì)胞缺乏端粒酶活性，染色體端粒長度隨細(xì)胞分裂次數(shù)增加而逐漸縮短。端粒酶活性是人類多能干細(xì)胞和ESC的標(biāo)志。AFSC具有端粒酶活性最早在1999年被檢測到，且發(fā)現(xiàn)AFSC的端粒酶活性可隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低［16］。而27年一項(xiàng)研究分離出的CD117+-AFSC在體外培養(yǎng)250代以上仍保持端粒長度和端粒酶活性［6］。這一矛盾的結(jié)果，提示AFSC在培養(yǎng)過程中是否能保持其端粒酶活性仍有待進(jìn)一步研究。免疫性：AFSC移植至體內(nèi)是否會引起宿主的免疫排斥是影響細(xì)胞移植后效果的一個重要因素。2011年一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與MSC類似，AFSC也可直接抑制淋巴細(xì)胞激活，并能分泌一些免疫調(diào)節(jié)因子，如GRO(growth-relatedoncogene)、單核細(xì)胞趨化蛋白家族、白細(xì)胞介素-6等，從而抑制免疫反應(yīng)；除此之外，AFSC可分泌巨噬細(xì)胞炎性蛋白3a、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1a、激活素和單核細(xì)胞趨化蛋白1,而低水平表達(dá)單核細(xì)胞趨化蛋白2［14］。由此推斷，AFSC在體外可抑制免疫反應(yīng)。一些細(xì)胞因子在AFSC與淋巴細(xì)胞的相互作用中起到關(guān)鍵作用，且可能存在特異性免疫抑制機(jī)制。最近一項(xiàng)研究顯示，CD117+-AFSC的免疫調(diào)節(jié)作用隨胎齡不同而改變，妊娠早期AFSC可明顯抑制T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的增殖，而妊娠中晚期AFSC的抑制作用較弱，且妊娠中期的AFSC具有抑制B細(xì)胞增殖的作用［17］。從而認(rèn)為妊娠早期AFSC具有和胚胎早期相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，而妊娠中晚期AFSC的免疫調(diào)節(jié)作用更類似于成人MSC，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要繼續(xù)探討。致瘤性：干細(xì)胞在體內(nèi)無限增殖形成腫瘤一直困擾著干細(xì)胞研究者，而AFSC在體內(nèi)并不會自發(fā)形成畸胎瘤。一項(xiàng)動物研究將培養(yǎng)的AFSC注入4周齡裸鼠后腿肌肉處，3個月后注射處肌肉的組織學(xué)檢查未顯示腫瘤形成［6］。另一項(xiàng)研究將不做任何處理的AFSC注入裸鼠背側(cè)，12周以后檢測無畸胎瘤形成，而用丙戊酸預(yù)處理過的AFSC注射入小鼠體內(nèi)則檢測到畸胎瘤的形成［11］。表明AFSC注射至體內(nèi)并不自發(fā)形成畸胎瘤，但是重編程后的AFSC具有致瘤性，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。通過不同傳送細(xì)胞的方式移植AFSC是否引起畸胎瘤的形成也需要深入探討。五、AFSC在疾病治療研究中的應(yīng)用盡管對于AFSC的分離鑒定仍存在許多問題，但已有大量體外實(shí)驗(yàn)或動物模型研究構(gòu)建出AFSC細(xì)胞系，并研究其分化能力和治療作用。AFSC在腦卒中和神經(jīng)系統(tǒng)分化中的作用：Tajir等［18］通過向缺血性卒中小鼠模型腦室內(nèi)注射AFSC，發(fā)現(xiàn)小鼠的運(yùn)動功能和認(rèn)知功能明顯恢復(fù)，組織學(xué)顯示梗死面積縮小，海馬齒狀回和側(cè)腦室室管膜下區(qū)細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67、神經(jīng)元標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白2水平明顯升高，提示AFSC可通過增強(qiáng)內(nèi)源性損傷修復(fù)機(jī)制在卒中的治療中發(fā)揮作用。在神經(jīng)系統(tǒng)分化調(diào)節(jié)的研究方面，有研究通過對一些標(biāo)記物進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，證明SOX9與AFSC的神經(jīng)發(fā)育潛能有關(guān)，SOX9基因敲除可抑制AFSC向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞分化［19］。AFSC在心肌梗死及血管再生中的作用：Bollin等［20］在急性心肌梗死小鼠模型中注入人AFSC，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞可以分泌心臟保護(hù)因子和促血管生成因子，推測AFSC可能通過旁分泌胸腺肽P4機(jī)制對心肌梗死有一定的治療作用。2012年，有研究發(fā)現(xiàn)AFSC在血管內(nèi)皮生長因子的誘導(dǎo)下可形成血管內(nèi)皮樣細(xì)胞［21］。將纖維蛋白/聚乙二醇凝膠作為支撐新生血管的生物支架的研究驗(yàn)證了AFSC和羊水干細(xì)胞來源的上皮細(xì)胞(AFSC-derivedendothelialcellAFSC-EC)體外血管形成的潛能［22］。在此基礎(chǔ)上，該研究團(tuán)隊(duì)將載有AFSC的纖維蛋白/聚乙二醇凝膠注射至裸鼠皮下，證實(shí)AFSC可在體內(nèi)原位形成血管內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞［23］，纖維蛋白/聚乙二醇凝膠載體的應(yīng)用也為細(xì)胞移植生物支架的開發(fā)提供了一種新的選擇。AFSC在肺上皮的重建和肺疾病治療中的作用：AFSC也可用于研究肺上皮的重建和肺疾病的細(xì)胞治療。高氧損傷肺組織中的2型肺泡上皮細(xì)胞可分泌一些肺泡上皮標(biāo)記物，使AFSC遷移至損傷區(qū)，促進(jìn)損傷愈合并誘導(dǎo)其分化為肺上皮細(xì)胞，在AFSC和2型肺泡上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)的過程中，能夠檢測到AFSC分泌的生長調(diào)節(jié)蛋白-a、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、巨噬細(xì)胞移動抑制因子、纖溶酶原激活物抑制劑1，這些細(xì)胞因子在抗炎和促進(jìn)損傷愈合方面發(fā)揮重要作用［24］。Grisafi等［25］在高氧損傷所致的支氣管肺發(fā)育異常小鼠模型中，用AFSC作為這種多因素肺疾病的治療工具，發(fā)現(xiàn)肺組織結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，可能是通過AFSC的旁分泌機(jī)制及免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)的。AFSC在腎損傷恢復(fù)中的作用：AFSC也可作為治療腎臟疾病的細(xì)胞來源。2010年，一項(xiàng)研究將AFSC直接注入急性腎小管壞死小鼠模型的腎壞死區(qū)，注入的細(xì)胞可分化為能表達(dá)腎近端和遠(yuǎn)端小管標(biāo)記物的細(xì)胞，并通過分泌一些細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進(jìn)腎功能的恢復(fù)［26］。Hauser等［27］通過靜脈內(nèi)注射AFSC的方式研究其對急性腎損傷腎功能恢復(fù)的影響，通過定位發(fā)現(xiàn)AFSC聚集于腎小管周圍毛細(xì)血管和間質(zhì)中，這些細(xì)胞可促進(jìn)腎小管細(xì)胞的增生和減少細(xì)胞凋亡，從而改善腎功能。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)顯示，這種作用是通過分泌一些生長因子和細(xì)胞因子而實(shí)現(xiàn)的，而并非通過移植細(xì)胞與損傷組織的結(jié)合發(fā)揮作用。上述研究與Perin等［26］研究結(jié)論不吻合的原因可能是細(xì)胞注射的部位和量不同。另一項(xiàng)研究進(jìn)一步驗(yàn)證了AFSC并非通過分化為腎臟細(xì)胞修復(fù)損傷腎的功能，而是通過激活A(yù)kt通路，分泌一些細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素-6、血管內(nèi)皮生長因子、SCF-1等）刺激腎小管細(xì)胞增生等途徑促進(jìn)腎功能恢復(fù)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞營養(yǎng)因子可增強(qiáng)AFSC的上述作用［28］。六、AFSC在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用理論上講，基因治療可以從根本上治療一些遺傳病，干細(xì)胞可作為基因治療的良好素材，但是由于技術(shù)上和倫理上的限制尚未應(yīng)用于臨床實(shí)踐。AFSC作為一種新型的多能干細(xì)胞，可用于遺傳病基因治療的研究。但是，想要應(yīng)用AFSC作為致病基因修復(fù)和自體細(xì)胞移植的細(xì)胞來源，必須要有良好的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)體系確保AFSC高效表達(dá)相關(guān)基因產(chǎn)物。近來，有研究應(yīng)用載有人類免疫缺陷病毒1型、脾病灶形成病毒的長末端重復(fù)序列啟動子以及標(biāo)記基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這些細(xì)胞可表達(dá)MSC表面標(biāo)記物，而不表達(dá)造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物，并具有分