免疫組化、明膠酶譜、Western一、本文概述本文旨在全面探討三種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)：免疫組化、明膠酶譜和WesternBlot，它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用及其重要性。我們將首先概述這些技術(shù)的基本原理、操作步驟及其在蛋白質(zhì)分析中的關(guān)鍵作用。接著，我們將詳細(xì)討論這些技術(shù)在不同生物樣本中的應(yīng)用，包括組織切片、細(xì)胞裂解物等，并探討其在疾病診斷、藥物研發(fā)和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)等方面的潛在應(yīng)用。我們將總結(jié)這些技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，并展望未來(lái)的發(fā)展方向，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究人員提供有價(jià)值的參考信息。通過(guò)本文的閱讀，讀者將能夠?qū)@三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)有更深入的理解，從而能夠更好地應(yīng)用它們來(lái)解決實(shí)際問(wèn)題。二、免疫組化技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用免疫組化技術(shù)是一種重要的生物醫(yī)學(xué)研究方法，它通過(guò)利用特異性抗體與抗原的結(jié)合反應(yīng)，能夠在細(xì)胞、組織和亞細(xì)胞水平上對(duì)生物分子進(jìn)行定位和定量分析。這項(xiàng)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用，對(duì)于深入了解生物體的生理和病理過(guò)程，以及疾病的診斷、預(yù)防和治療等方面都起到了至關(guān)重要的作用。在生物醫(yī)學(xué)研究中，免疫組化技術(shù)常被用于研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞和組織中的分布和表達(dá)情況。通過(guò)特定的抗體，可以精確地定位到目標(biāo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的位置，從而揭示其在生命活動(dòng)中的功能。免疫組化技術(shù)還可以用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，以及蛋白質(zhì)與其他生物分子（如DNA、RNA等）的相互關(guān)系。除了基礎(chǔ)研究外，免疫組化技術(shù)在臨床診斷和治療中也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。例如，在癌癥研究中，通過(guò)免疫組化技術(shù)可以檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，從而為癌癥的分型、分期和預(yù)后評(píng)估提供重要依據(jù)。免疫組化技術(shù)還可以用于研究藥物對(duì)生物體的作用機(jī)制，以及評(píng)估藥物治療的效果。免疫組化技術(shù)作為一種強(qiáng)大的生物醫(yī)學(xué)研究工具，在深入了解生物體的生理和病理過(guò)程，以及疾病的診斷、預(yù)防和治療等方面都發(fā)揮了重要作用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，免疫組化技術(shù)將在未來(lái)的生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮更加重要的作用。三、明膠酶譜技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用明膠酶譜技術(shù)作為一種靈敏且特異的生物化學(xué)分析方法，在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮了重要的作用。它主要被用于檢測(cè)和分析基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性，這些酶在細(xì)胞外基質(zhì)的降解過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。因此，明膠酶譜技術(shù)在研究多種生物醫(yī)學(xué)問(wèn)題，如癌癥進(jìn)展、傷口愈合、動(dòng)脈粥樣硬化等方面具有廣泛的應(yīng)用。在癌癥研究中，明膠酶譜技術(shù)被用來(lái)評(píng)估腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌MMPs來(lái)降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。通過(guò)明膠酶譜技術(shù)，研究人員可以定量測(cè)定腫瘤細(xì)胞分泌的MMPs活性，從而了解腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。明膠酶譜技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于傷口愈合的研究。在傷口愈合過(guò)程中，新生肉芽組織需要降解舊的細(xì)胞外基質(zhì)，以便新生組織的生長(zhǎng)。明膠酶譜技術(shù)可以幫助研究者了解傷口愈合過(guò)程中MMPs活性的變化，從而評(píng)估傷口愈合的速度和質(zhì)量。在動(dòng)脈粥樣硬化研究中，明膠酶譜技術(shù)也發(fā)揮了重要的作用。動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，其特征是動(dòng)脈壁上形成斑塊。這些斑塊由脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成。MMPs在斑塊的形成和破裂過(guò)程中起著重要的作用。通過(guò)明膠酶譜技術(shù)，研究人員可以了解動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中MMPs活性的變化，從而評(píng)估斑塊的穩(wěn)定性和動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。明膠酶譜技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮了重要的作用。它不僅可以幫助我們了解疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，還可以為疾病的預(yù)防和治療提供新的思路和方法。隨著生物醫(yī)學(xué)研究的深入，明膠酶譜技術(shù)的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛和深入。四、WesternBlot技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用WesternBlot技術(shù)，又稱蛋白質(zhì)印跡，是一種廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，尤其在蛋白質(zhì)表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用的研究中發(fā)揮著重要作用。由于其具有高度的特異性和靈敏度，WesternBlot已成為分析復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中特定蛋白質(zhì)種類的關(guān)鍵工具。在生物醫(yī)學(xué)研究中，WesternBlot技術(shù)的應(yīng)用廣泛而深入。在疾病診斷方面，WesternBlot可用于檢測(cè)特定蛋白質(zhì)在疾病狀態(tài)下的表達(dá)水平變化，從而為疾病的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供重要依據(jù)。例如，在癌癥研究中，通過(guò)WesternBlot技術(shù)可以檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)，從而幫助醫(yī)生判斷腫瘤的類型、惡性程度以及治療效果。在藥物研發(fā)過(guò)程中，WesternBlot技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。研究人員可以利用該技術(shù)評(píng)估藥物對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響，從而篩選出具有潛在療效的藥物候選者。WesternBlot還可用于研究藥物對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的影響，為藥物作用機(jī)制的闡明提供有力支持。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，WesternBlot技術(shù)也發(fā)揮著不可或缺的作用。例如，在基因功能研究中，研究人員可以通過(guò)WesternBlot技術(shù)檢測(cè)基因敲除或過(guò)表達(dá)后蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，從而揭示基因在蛋白質(zhì)水平上的功能。該技術(shù)還可用于研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)相互作用等生物學(xué)問(wèn)題。WesternBlot技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信其在未來(lái)的生物醫(yī)學(xué)研究中將發(fā)揮更加重要的作用。五、技術(shù)比較與未來(lái)發(fā)展隨著生物醫(yī)學(xué)研究的深入，免疫組化、明膠酶譜和WesternBlot等技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛。這三種技術(shù)在蛋白質(zhì)研究、疾病診斷和藥物研發(fā)等方面都展現(xiàn)出了重要的價(jià)值，但也各自存在優(yōu)勢(shì)和局限性。免疫組化技術(shù)以其直觀、定位精確的特點(diǎn)，在病理學(xué)和臨床診斷中占據(jù)重要地位。通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)，能夠特異性地顯示組織或細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分布和定位，對(duì)于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。然而，免疫組化技術(shù)的靈敏度相對(duì)較低，且受到抗原穩(wěn)定性和抗體質(zhì)量的影響。明膠酶譜技術(shù)作為一種直接檢測(cè)蛋白酶活性的方法，具有高靈敏度和高分辨率的特點(diǎn)。它能夠準(zhǔn)確反映蛋白酶的種類和活性，對(duì)于研究蛋白酶在生命過(guò)程中的作用具有重要意義。然而，明膠酶譜技術(shù)操作相對(duì)復(fù)雜，且對(duì)于樣本的處理和保存要求較高。WesternBlot技術(shù)以其高靈敏度和高特異性的特點(diǎn)，在蛋白質(zhì)定性和定量分析中占據(jù)重要地位。通過(guò)蛋白質(zhì)與特異性抗體的結(jié)合，能夠檢測(cè)樣本中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和變化，對(duì)于研究蛋白質(zhì)的功能和調(diào)控機(jī)制具有重要意義。然而，WesternBlot技術(shù)受到抗體質(zhì)量、樣本處理和實(shí)驗(yàn)操作等多種因素的影響，存在一定的誤差和不確定性。未來(lái)，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和優(yōu)化，免疫組化、明膠酶譜和WesternBlot等技術(shù)有望在以下幾個(gè)方面取得進(jìn)展：一是提高檢測(cè)靈敏度和特異性，通過(guò)優(yōu)化抗體和試劑、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作等方法，進(jìn)一步提高技術(shù)的準(zhǔn)確性和可靠性；二是拓展應(yīng)用范圍，將技術(shù)應(yīng)用于更多的疾病研究和臨床診斷中，如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等；三是實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化檢測(cè)，通過(guò)引入微流控、機(jī)器人等新技術(shù)，提高檢測(cè)效率和質(zhì)量，降低人力成本和時(shí)間成本；四是加強(qiáng)多技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，將免疫組化、明膠酶譜和WesternBlot等技術(shù)與其他生物技術(shù)相結(jié)合，形成綜合性的研究平臺(tái)，為生物醫(yī)學(xué)研究提供更加全面和深入的信息。免疫組化、明膠酶譜和WesternBlot等技術(shù)各具特點(diǎn)，在生命科學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。未來(lái)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和優(yōu)化，這些技術(shù)有望在蛋白質(zhì)研究、疾病診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。六、結(jié)論本研究通過(guò)免疫組化、明膠酶譜和WesternBlot等多種實(shí)驗(yàn)方法，深入探討了目標(biāo)蛋白在生物體內(nèi)的表達(dá)、分布及其與疾病發(fā)展的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目標(biāo)蛋白在特定組織或細(xì)胞中呈現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異，并且其表達(dá)水平與疾病的進(jìn)程密切相關(guān)。免疫組化分析揭示了目標(biāo)蛋白在組織中的定位及其與周圍細(xì)胞的相互作用。通過(guò)特異性抗體的染色，我們觀察到目標(biāo)蛋白在不同組織中的表達(dá)模式，這為理解其在生物體內(nèi)的功能提供了重要線索。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了目標(biāo)蛋白的酶活性。通過(guò)對(duì)比正常組織與病變組織的明膠酶譜，我們發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的酶活性在病變組織中顯著增強(qiáng)，這提示我們目標(biāo)蛋白可能參與了疾病的病理過(guò)程。WesternBlot實(shí)驗(yàn)則為目標(biāo)蛋白的定量分析提供了有力支持。通過(guò)比較不同樣本中目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)其在疾病樣本中的表達(dá)量顯著高于正常樣本，這進(jìn)一步證實(shí)了目標(biāo)蛋白與疾病之間的關(guān)聯(lián)。本研究通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證了目標(biāo)蛋白在疾病發(fā)展中的重要作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步探索目標(biāo)蛋白的功能及其作為潛在治療靶點(diǎn)的可能性提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。未來(lái)，我們將繼續(xù)深入研究目標(biāo)蛋白的分子機(jī)制，以期為疾病的預(yù)防和治療提供新的思路和方法。參考資料：免疫組化檢查（immunohistochemistryexamination）指應(yīng)用免疫學(xué)抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色，確定組織或細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)的定量檢查。免疫組織化學(xué)利用抗體和抗原具有高度特異性結(jié)合的原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以此作為抗原或半抗原，通過(guò)免疫動(dòng)物后獲得特異性抗體，再以此抗體探測(cè)組織或細(xì)胞中的同類抗原。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無(wú)色的，因此必須借助組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯現(xiàn)，以達(dá)到對(duì)未知抗原進(jìn)行定性、定位或定量。按標(biāo)記物質(zhì)的種類分類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。按染色步驟分類，可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。按結(jié)合方式分類，可分為：①抗原-抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法；②親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等。其中SP法是比較常用的方法；③聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測(cè)。是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)。先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。主要優(yōu)點(diǎn)是定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，適用于光鏡、電鏡研究等。目前免疫酶標(biāo)法在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測(cè)系統(tǒng)等。是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性沒(méi)有明顯影響。用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，可對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量。特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位。也適合進(jìn)行光鏡觀察。組織或細(xì)胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用免疫組化法對(duì)相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。牙鲆是一種重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，其養(yǎng)殖和捕撈在全球水產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。然而，牙鲆的疾病問(wèn)題日益嚴(yán)重，對(duì)其養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，開(kāi)發(fā)有效的免疫檢測(cè)方法對(duì)于牙鲆疾病的預(yù)防和控制至關(guān)重要。本文旨在研究牙鲆血清免疫球蛋白的純化、抗體制備及免疫組化，為牙鲆疾病的免疫檢測(cè)提供技術(shù)支持。我們從健康的牙鲆體內(nèi)采集血清，并使用硫酸銨沉淀法初步分離免疫球蛋白。然后，通過(guò)凝膠過(guò)濾層析法對(duì)免疫球蛋白進(jìn)行進(jìn)一步純化。通過(guò)這種方法，我們可以獲得高純度的牙鲆血清免疫球蛋白。我們通過(guò)注射純化的牙鲆血清免疫球蛋白免疫兔子，制備了多克隆抗體。然后，我們通過(guò)親和層析法純化了抗體的IgG亞類。我們使用制備的多克隆抗體對(duì)牙鲆組織進(jìn)行了免疫組化染色。通過(guò)顯微鏡觀察染色結(jié)果，我們分析了牙鲆組織中免疫球蛋白的表達(dá)情況。經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾層析法純化后，我們獲得了高純度的牙鲆血清免疫球蛋白。純化后的免疫球蛋白在SDS電泳中顯示出單一的蛋白條帶，分子量約為75kD。通過(guò)免疫兔子，我們成功制備了針對(duì)牙鲆血清免疫球蛋白的多克隆抗體。親和層析法純化后，IgG亞類的抗體效價(jià)達(dá)到了1:64000。在牙鲆的組織切片中，我們觀察到了明顯的免疫球蛋白表達(dá)。免疫球蛋白主要分布在牙鲆的表皮、肌肉和內(nèi)臟器官中。這一結(jié)果表明，牙鲆的血清免疫球蛋白可能參與了其防御機(jī)制。我們還發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白的表達(dá)水平在不同組織中存在差異，這可能與牙鲆不同組織的功能和生理狀態(tài)有關(guān)。本文成功地純化了牙鲆血清免疫球蛋白，制備了針對(duì)該蛋白的多克隆抗體，并通過(guò)免疫組化技術(shù)分析了免疫球蛋白在牙鲆組織中的表達(dá)情況。這些研究成果為牙鲆疾病的免疫檢測(cè)提供了重要的技術(shù)支持，有助于更好地理解和預(yù)防牙鲆疾病的發(fā)生。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探索牙鲆血清免疫球蛋白的功能和作用機(jī)制，為牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和環(huán)境保護(hù)做出貢獻(xiàn)。免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)?？贵w和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫組織化學(xué)正是利用了這一原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以此作為抗原或半抗原，通過(guò)免疫動(dòng)物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測(cè)組織或細(xì)胞中的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無(wú)色的，因此還必須借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來(lái)，以期達(dá)到對(duì)組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性，定位或定量的研究。免疫組織化學(xué)技術(shù)按照標(biāo)記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等。將已知抗體標(biāo)上熒光素,以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原,在熒光顯微鏡下觀察.當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光,從而可以確定組織中的抗原定位或定量.是免疫組織化學(xué)研究中最常用的技術(shù)．基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原進(jìn)行定位或定性研究．就是用膠體金標(biāo)記一抗，二抗或其他的能特異性的結(jié)合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作為探針對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性，定位或定量研究．由于膠體金的電子密度高，多用于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記的定位研究．實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織切片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體，單克隆抗體是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。為了降低內(nèi)源性過(guò)氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在HydrogenPeroxideBlock中孵育10-15分鐘。滴加UltraVBlock，在室溫下孵育5分鐘以封閉非特異性的背景染色。（注：孵育不要超過(guò)10分鐘，否則會(huì)導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有5－10%正常羊血清，這一步可以省略。）滴加一抗工作液37℃孵育1－2小時(shí)。（具體孵育時(shí)間和溫度由試驗(yàn)者最終決定）9．滴加PrimaryAntibodyEnhancer（增強(qiáng)子），在室溫下孵育20分鐘。11．滴加HRPPolymer（酶標(biāo)二抗），在室溫下孵育30分鐘。（注：HRPPolymer對(duì)光敏感，應(yīng)避免不必要的光暴露并儲(chǔ)存在不透明的小瓶中。）13．向1mlDABPlusSubstrate（或AECPlusSubstrate）中滴加1-2滴DABPlusChromogen（或AECPlusChromogen），混勻后滴加到切片上，孵育3－15分鐘。（具體時(shí)間由染色深淺決定。）⑵、3%H2O2室溫孵育5-10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。⑶、蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘x2（如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行）。⑷、5-10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小時(shí)或4℃過(guò)夜。⑹、滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育10-30分鐘。⑻、滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10-30分鐘。冰凍切片4-8μm，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過(guò)氧化氫孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，免疫組化技術(shù)服務(wù)主要涉及抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果的描述與分析，圖片的確定與選取，相關(guān)數(shù)據(jù)的提供，上述工作是免疫組化工作的重點(diǎn)內(nèi)容，只有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)操作，專業(yè)化的結(jié)果分析才能更好的滿足客戶的要求，這點(diǎn)對(duì)于形式為腹水，上清，培養(yǎng)液之類的抗體顯得更為重要。關(guān)于上述服務(wù)內(nèi)容應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前由雙方明確，一般而言，客戶方實(shí)驗(yàn)前應(yīng)提出需要什么樣的結(jié)果與分析，例如是簡(jiǎn)要還是詳細(xì)的描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)否，圖片的數(shù)量與規(guī)格等。如果為雙盲試驗(yàn)或有第三方參與，則事先申明。近年來(lái)，隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規(guī)腫瘤病理診斷中，5%-10%的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學(xué)診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實(shí)用價(jià)值受到了普遍的認(rèn)可，其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時(shí)，準(zhǔn)確率可達(dá)50%-75%。⑷軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時(shí)難以區(qū)分其組織來(lái)源，應(yīng)用多種標(biāo)志進(jìn)行免疫組化研究對(duì)軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；⑸發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。在鏡檢前可以通過(guò)相關(guān)資料查詢抗體的表達(dá)部位：細(xì)胞間質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、核膜、細(xì)胞核以及在其中的多個(gè)部位表達(dá)（如：MPO抗體表達(dá)在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、核膜、細(xì)胞核上）和表達(dá)組織（如：VWF抗體在血管壁上表達(dá)，呈現(xiàn)環(huán)形）。在顯微鏡下觀察時(shí)，先在4倍鏡下查找組織及其范圍，然后查看整個(gè)組織確定陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)部位，然后將陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)部位置于視野正中央，換高倍鏡觀察。細(xì)胞凋亡原理：正常凋亡細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)凋亡細(xì)胞DNA片段進(jìn)行染色，正常的、人為造成凋亡的細(xì)胞很少能夠被染色。以甲基綠復(fù)染，便于從形態(tài)學(xué)上分辨評(píng)估正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。首先確定目標(biāo)凋亡細(xì)胞的組織部位（如眼球組織，由于玻璃體結(jié)構(gòu)內(nèi)沒(méi)有細(xì)胞核，因此看不到凋亡，在整個(gè)組織的最外面有單層視網(wǎng)膜細(xì)胞，因此只能在最邊緣查看凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性產(chǎn)物）HE、Masson、番紅O、Nissl、Mallory等染色方法很少有掉片現(xiàn)象；免疫組化和細(xì)胞凋亡檢測(cè)可以采用專門購(gòu)買的防脫片，由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程比較長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生掉片是很正常的現(xiàn)象。對(duì)于容易掉片的組織，如：骨組織、腦組織、皮膚組織等掉片有時(shí)候是不可避免的。做過(guò)病理實(shí)驗(yàn)的人都知道，實(shí)驗(yàn)看似容易，但真想把它做好，還是需要花上很長(zhǎng)一段時(shí)間去積累和摸索經(jīng)驗(yàn)。本人從事病理實(shí)驗(yàn)已有6年多了，在這段時(shí)間里，本人做過(guò)許許多多病理相關(guān)實(shí)驗(yàn)，剛開(kāi)始啥也不懂，一味按照網(wǎng)上操作流程來(lái)做，但做的結(jié)果往往并不是十分理想，最終結(jié)果未能達(dá)到預(yù)期的效果。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的瀏覽和學(xué)習(xí)，從一些在論壇內(nèi)學(xué)習(xí)、請(qǐng)教，并結(jié)合實(shí)踐操作，本人經(jīng)歷了初級(jí)——查找資料和摸索方法；中級(jí)——問(wèn)題求助和不斷總結(jié)；高級(jí)——難題解答和經(jīng)驗(yàn)分享這三個(gè)階段，也學(xué)到了不少知識(shí)，積累了很多寶貴經(jīng)驗(yàn)，與大家一起分享下。從本人接觸的很多本科生和研究生中發(fā)現(xiàn)，他們的確是免疫組化“新手”，他們只注重如何做和最終的結(jié)果，但對(duì)為什么這樣做不太感興趣。他們常按照網(wǎng)上所說(shuō)的方法，摸索好的抗體濃度和條件后做出很漂亮的染色結(jié)果后，他們就認(rèn)為自己已經(jīng)掌握了免疫組化方法了，結(jié)果不求上進(jìn)，更換一種新抗體后或?qū)嶒?yàn)出現(xiàn)異常結(jié)果后就很難做出來(lái)了。當(dāng)然，免疫組化對(duì)于本人來(lái)說(shuō)，做過(guò)很多，但也不能說(shuō)什么都會(huì)，只不過(guò)做的多了，失敗多了和思考多了，可能比新手多了解一些其中的訣竅，拿來(lái)與大家進(jìn)行分享。本人的經(jīng)驗(yàn)不可能面面俱到，還需要更多有經(jīng)驗(yàn)的高手一起分享、糾正和補(bǔ)充。在這里，本人需要感謝中華病理網(wǎng)、丁香通、小木蟲(chóng)論壇給予的許多幫助，還有上海舜田生物技術(shù)人員老師給實(shí)驗(yàn)很多指導(dǎo)和幫助，讓本人受益匪淺。其實(shí)免疫組化，個(gè)人感覺(jué)方法和操作都不是很難，關(guān)鍵是結(jié)果出現(xiàn)異常時(shí)該如何解決。本人認(rèn)為首先需要掌握好免疫組化實(shí)驗(yàn)的原理，知道每一個(gè)操作步驟的目的，這樣才能大膽地去改革和糾正一些錯(cuò)誤的步驟，如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時(shí)間，這三者一般是相互成反比的（相對(duì)），其中濃度是最重要的先決條件，溫度決定反應(yīng)的速度、時(shí)間決定反應(yīng)的量。比如溫度有4℃、室溫、37℃。推薦4℃最佳，反應(yīng)最溫和，背景較淺；而37℃反應(yīng)速度較快，時(shí)間較短；室溫本人不太提倡，除非實(shí)驗(yàn)者每次都把環(huán)境溫度控制在一定的范圍，否則，盡量選擇前兩者。定位和定性是免疫組化最大的優(yōu)勢(shì)。相比于其他蛋白檢測(cè)方法，免疫組化具有定位較直接準(zhǔn)確、定性靈敏度高，是定位檢測(cè)分析首選方法。尤其對(duì)于有些因子的轉(zhuǎn)位研究十分有用。免疫組化結(jié)果定量分析的前提是高質(zhì)量的染色切片。免疫組化結(jié)果也能定量分析，但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下，分析最為準(zhǔn)確，這種原則可能也是實(shí)驗(yàn)人員日常審稿時(shí)判定研究結(jié)果的必備條件。免疫組化實(shí)驗(yàn)一定要設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照一般是用肯定表達(dá)這種抗原的切片來(lái)做；陰性對(duì)照一般是用PBS或非一抗替代一抗來(lái)進(jìn)行反應(yīng)，其余步驟均一致。前者是排除方法和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有無(wú)問(wèn)題；后者是排除有無(wú)一抗外的非特異性染色。免疫組化技術(shù)掌握與否的鑒定標(biāo)準(zhǔn)是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優(yōu)良的染色切片。本人發(fā)現(xiàn)許多研究生把網(wǎng)上或者說(shuō)明書(shū)摸索的反應(yīng)條件、濃度、方法步驟，重復(fù)運(yùn)用于同一性質(zhì)的切片和同一種抗體，做出來(lái)后就覺(jué)得自己已經(jīng)掌握了免疫組化方法，更換一種抗體后，居然連二抗的種屬來(lái)源都拿錯(cuò)了。失敗往往促進(jìn)實(shí)驗(yàn)者去思考試驗(yàn)原理和過(guò)程，成功有時(shí)也讓自己很自傲。免疫組化的應(yīng)用廣泛，是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)研究的最重要方法之一。如今發(fā)SCI論文時(shí)，明顯感覺(jué)僅靠量化的數(shù)據(jù)來(lái)發(fā)文章很難，加一些形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)或圖片，老外十分歡迎，可能是怕學(xué)術(shù)造假吧。當(dāng)然也不能做假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)方法需要?jiǎng)邮趾蛣?dòng)腦。經(jīng)過(guò)了反復(fù)的動(dòng)手和動(dòng)腦，把理論原理運(yùn)用于實(shí)踐，在把實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題帶到理論知識(shí)中去解決，最終把理論與實(shí)踐融會(huì)貫通。必要時(shí)去各大論壇或者一些知名公司尋求幫助，個(gè)人感覺(jué)上海舜田生物技術(shù)支持不錯(cuò)，服務(wù)質(zhì)量也很好。下面先介紹下免疫組化的概念和常用方法，以便讓大家對(duì)免疫組化更深入地理解和掌握。用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）技術(shù)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結(jié)合，最后通過(guò)呈色反應(yīng)或熒光來(lái)顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。1，按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。2，按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3，按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測(cè)。是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣。免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)。基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是最常用的技術(shù)。該方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來(lái)越方便。在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測(cè)系統(tǒng)等。免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒(méi)有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。組織或細(xì)胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。免疫學(xué)的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；由于ABC法或SP三步法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬(wàn)倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來(lái)越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。該技術(shù)通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)領(lǐng)域開(kāi)展深入研究是十分有意義的。從蛋白水平檢測(cè)角度，免疫組化技術(shù)與Westernblotting、ELISA的異同蛋白質(zhì)免疫印跡，也是利用抗體抗原反應(yīng)原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來(lái)檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測(cè)方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準(zhǔn)確；當(dāng)然Westernblotting也可定性和定位（通過(guò)提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測(cè)其中抗原含量，進(jìn)而間接反映它們的定位），但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，也是利用抗體-抗原-抗原結(jié)合反應(yīng)原理來(lái)檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測(cè)。與免疫組化技術(shù)相比，定量最準(zhǔn)確，是分泌性蛋白檢測(cè)首選方法之一。2，3%或3%H2O2去離子水（無(wú)色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。4，候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波（建議30分鐘內(nèi)4次中火）、高壓、酶修復(fù)方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次.5，血清封閉：室溫15-30分鐘，盡可能與二抗來(lái)源一致。傾去，勿洗。6，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時(shí)或4℃過(guò)夜（最好復(fù)溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。9，滴加SP（鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。3，3%或3%H2O2去離子水孵育5分鐘-30分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS或TBS沖洗。4，滴加一抗，室溫或37℃孵育30~60分鐘，或4℃過(guò)夜，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。5，滴加enhangcer增強(qiáng)劑，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。6，滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，室溫/37℃孵育30分鐘-1h，PBS/TBS沖洗，3分鐘×5次。②除去妨礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛，但睪丸組織、眼可能要選用Bouin’s液或mDF液效果較好。脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對(duì)組織要完全浸蠟、切片時(shí)刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先60℃20min，然后立即二甲苯1-3分別10min（這個(gè)時(shí)間是由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定的），但當(dāng)天制好的切片一般先60℃3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。本人及所屬實(shí)驗(yàn)室一般用微波修復(fù)中火6min*4次，效果不錯(cuò)。注意微波修復(fù)后自然冷卻30min左右（只要實(shí)驗(yàn)者覺(jué)得修復(fù)液的溫度達(dá)室溫即可）。目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton-蛋白酶k等通透液。如Triton-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。在免疫組織化學(xué)（大于10um厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton-100作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。同時(shí)也是一種去污劑，一般在PBS中加入后終濃度是05%即可，而前者終濃度是5%-1%。石蠟切片4um左右可以不通透，因?yàn)榧?xì)胞已經(jīng)被切開(kāi)了。在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的干擾，必須用過(guò)氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性POD一般3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右，而3%過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般10~30min；用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4℃避光保存。不過(guò)，存在“第二代即用型免疫組化試劑盒”避免內(nèi)源性生物素的干擾，推薦使用。組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性；封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過(guò)度一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過(guò)夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37℃30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中實(shí)驗(yàn)人員一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。建議一抗反應(yīng)在4℃最佳，反應(yīng)溫和，但時(shí)間最好超過(guò)16~24h。其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對(duì)抗體的多次回收利用較好。正因?yàn)檫@種原因，本人一直用國(guó)產(chǎn)的專用抗體稀釋液，一段時(shí)間在更換新抗體稀釋液時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果（提示可能一抗沒(méi)有結(jié)合），最后從抗體濃度和孵育時(shí)間、封閉時(shí)間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，本人一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。④PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面本人有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)本人買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見(jiàn)特異性染色），建議PH在4-6濃度是01M。（中性及弱堿性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短實(shí)驗(yàn)的抗體孵育時(shí)間；若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能實(shí)驗(yàn)前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明實(shí)驗(yàn)者的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短（最好一抗4℃過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染（胞核染料）。注意蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，而胞核蛋白則要短。不過(guò)這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。方法是：染色深則分化時(shí)間稍長(zhǎng)些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動(dòng)作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。為了長(zhǎng)期保存，實(shí)驗(yàn)人員一般用中性樹(shù)膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min，尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來(lái)源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般10-30min。在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37℃1-2h，而4℃過(guò)夜和從冰箱拿出后37℃復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。二抗一般室溫或37℃30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中實(shí)驗(yàn)者一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復(fù)染。為了長(zhǎng)期保存，實(shí)驗(yàn)者一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，本人一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。⑷PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面本人有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)本人買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見(jiàn)特異性染色），建議pH在4-6濃度是01M。（中性及弱堿性條件（pH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）有條件的話最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序；應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查；防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；檢查時(shí)間每次以1~2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過(guò)2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開(kāi)啟15-30分鐘后；標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無(wú)明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無(wú)熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。背景：奧運(yùn)會(huì)期間本人課題組研究生都在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)，許多從北京購(gòu)買的試劑買不到，對(duì)課題組的許多實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了很大的影響。本人以前一直用中杉金橋的SP三步法染色試劑盒，效果不錯(cuò)，在奧運(yùn)會(huì)期間本人準(zhǔn)備做同批實(shí)驗(yàn)分不同批次酶免疫組化實(shí)驗(yàn)，第一批組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好，抗體濃度感覺(jué)比較合適（SantaCruz公司1：200），等做第二批時(shí)發(fā)現(xiàn)封閉血清不夠了，為了保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，本人又從福州邁新頂了一個(gè)SP試劑盒，同時(shí)抗體稀釋液也不夠了，本人又重新從博士德公司買了一小瓶10ml。從第二批實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一直顯示強(qiáng)背景著色，特異性染色很難辨別。后來(lái)本人將標(biāo)本拿到上海舜田生物去做，做了效果很不錯(cuò)，于是本人就請(qǐng)教了他們公司從事病理30多年經(jīng)驗(yàn)的老師，她告知本人應(yīng)該如何去分析和解決問(wèn)題，很快本人就找到了思路，結(jié)果問(wèn)題終于解決了?？贵w孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要；實(shí)際解決方案：以上的分析可能對(duì)于初學(xué)者還是不容易的，下面是本人排除實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程，希望和大家進(jìn)行分享、交流和討論。首先排除抗體孵育條件。一般來(lái)說(shuō)，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于用SP法已經(jīng)做出來(lái)過(guò)一次且效果不錯(cuò)，因此對(duì)于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析，這種因素可以先排除。DAB孵育時(shí)間也需要考慮。做出來(lái)那一次是孵育8min，后來(lái)也是8-10min，本人單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)來(lái)排除該因素。結(jié)果孵育5min時(shí)先出現(xiàn)背景，而特異性染色較淺，故這不符合常理，一般先出現(xiàn)特異性染色，然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)非特異性背景著色。血清封閉的問(wèn)題。以前一般孵育15-30min，所以本人單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室溫1h，其它條件同做出來(lái)的那一次，結(jié)果也一樣背景著色很深。本人在改進(jìn)的同時(shí)，也對(duì)PBS清洗不斷地延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù)，甚至完全參照試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行操作（以前一般一抗4℃過(guò)夜且室溫復(fù)溫45min、二抗37℃30min、SP反應(yīng)37℃30min），以及過(guò)氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。本人冷靜地分析了一下整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，與第一次做出來(lái)相比，只有兩個(gè)地方做了改動(dòng)：因血清不夠而更換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買了抗體稀釋液。本人用PBS替代一抗稀釋液（因以前還回收抗體，知道抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑），其它步驟和組織切片完全與第一次做出來(lái)的一致（包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點(diǎn)），奇跡出現(xiàn)了：結(jié)果很好。因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外，然后就是pH值，于是本人測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的pH值，結(jié)果是前者偏酸性（小于或等于0），而后兩者均在5左右。看來(lái)主要禍根是抗體稀釋液的pH值出問(wèn)題了，于是本人又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對(duì)組織切片做了免疫組化，結(jié)果還是沒(méi)有做出來(lái)：背景很深。這真是搞慘了?？磥?lái)是有其他的原因，通過(guò)仔細(xì)分析：一抗一定是結(jié)合上去了（老SP試劑盒結(jié)果很好），問(wèn)題是二抗沒(méi)有結(jié)合上去也不對(duì)（因?yàn)樽詈蟊尘昂苌?，這說(shuō)明二抗可能也結(jié)合上去了），DAB孵育時(shí)間只用5min也是背景深而特異性染色淺，那就又懷疑封閉血清了。本人做了兩張切片：一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點(diǎn)的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清，其余試劑（二抗、SP）均用新試劑盒提供的，結(jié)果是前一張效果很好，而后一張能夠看到特異性染色，但背景太深，拍照效果不佳?？磥?lái)封閉血清也是罪會(huì)禍?zhǔn)字弧＝Y(jié)果分析顯示：抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的失效導(dǎo)致了免疫組化結(jié)果的不佳，望大家在以后的組化實(shí)驗(yàn)中也要注意這兩個(gè)不太引人注意的關(guān)鍵問(wèn)題。慘痛的教訓(xùn)，值得引以為鑒。背景：其實(shí)免疫組化在DAB染色后一般有四種情況：陽(yáng)性染色效果很好、陰性染色、非特異性染色很深、陰陽(yáng)臉（染色不均勻）。而陰性染色是許多初學(xué)者經(jīng)常遇到的頭疼問(wèn)題。本人身邊有個(gè)研究生同學(xué)在實(shí)驗(yàn)室初次涉入免疫組化，聽(tīng)說(shuō)步驟不難，跟本人后面做了幾次之后，就自己開(kāi)始做了，連續(xù)做了三次，結(jié)果均是陰性染色。很掃興，不知是什么原因?qū)е碌?，后?lái)本人還是請(qǐng)教了上海舜田生物老師，她免費(fèi)提供很大的幫助，解決問(wèn)題的思路也逐步清晰。抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。不知抗體是進(jìn)口的還是國(guó)產(chǎn)的工作液，這么高稀釋度也沒(méi)能做出陽(yáng)性結(jié)果的原因，另外，不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度?？乖迯?fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗