第四章動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)：在無菌條件下，從機體中取出組織或細胞，或利用已經(jīng)建立的動物細胞系，模擬機體內(nèi)的正常生理狀態(tài)下生存的基本條件，讓細胞在培養(yǎng)容器中生存、生長和繁殖的方法。動物細胞體外培養(yǎng)簡化環(huán)境條件，排除了體內(nèi)實驗受到的各種復雜因素的影響，便于應用各種物理、化學和生物等外界因素探索和揭示細胞生命活動的基本規(guī)律；便于應用各種技術和方法研究和觀察細胞結(jié)構與功能的變化；可以在長時間內(nèi)研究和觀察細胞遺傳行為的變化；可以同時提供大量生物性質(zhì)相同的細胞，特別是人的活細胞作為研究對象，不僅成本低，而且解決了不能用人作實驗的問題。動物細胞產(chǎn)品的醫(yī)學應用，促進動物細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展，下表列出動物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)品及醫(yī)學應用。第一節(jié)細胞培養(yǎng)物的特性組織培養(yǎng)：動物組織在體外條件下的保存或生長，此時可能有組織分化，并保持組織的結(jié)構和功能。器官培養(yǎng)：器官的胚芽、整個器官或器官的一部分在體外條件下的保存或生長，此時可能有器官的分化，并保持器官的三維立體結(jié)構和功能。原代培養(yǎng)：首次分離組織的培養(yǎng)細胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)成功傳代有限細胞系：細胞系不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限細胞株：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標志的培養(yǎng)物。一細胞的貼壁依賴性生長貼壁依賴性細胞：需要貼附到固體介質(zhì)上才能生存和生長的細胞?？煞譃槌衫w維細胞型、上皮樣細胞型、游走細胞型、多樣性細胞型和懸浮型細胞等。解離組織和貼壁的細胞時，用蛋白酶消化某些胞外基質(zhì)，降解穿膜蛋白的某些胞外基團，使細胞變成游離。解離的細胞呈規(guī)則的圓形。細胞貼壁后，逐漸變成特有的形狀。游走細胞型，需要在支持物上生長，一般不連接成片，細胞質(zhì)出現(xiàn)偽足或突起，呈活躍的游走和變形運動，速度快且方向不規(guī)則。多形性細胞型，難以確定細胞的穩(wěn)定形態(tài)，如神經(jīng)組織的細胞等。懸浮型細胞（非貼壁依賴性細胞），呈圓形，不貼附在支持物上，呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)生長。如血液細胞，淋巴組織細胞及腫瘤細胞。成纖維細胞型（如圖）：形態(tài)相似于體內(nèi)成纖維細胞，呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有圓形核，胞質(zhì)向外伸出2－3個長短不同的突起。細胞群常借原生質(zhì)突連接成網(wǎng)，生長時呈反射狀、漩渦或火焰狀發(fā)展。除真正的成纖維細胞外，凡來自中胚層間質(zhì)的其它組織細胞，如血管內(nèi)皮、心肌、平滑肌、成骨細胞等，也多成纖維細胞狀態(tài)。上皮細胞型，細胞呈扁平的不規(guī)則多角形，中央有圓形核，生長時彼此緊密連接成單層細胞群。起源于外胚胎和內(nèi)胚層組織的細胞，如皮膚表皮及其衍生物、腸管上皮、肝、胰和肺泡上皮細胞培養(yǎng)時呈上皮細胞型。二細胞培養(yǎng)物1原代培養(yǎng)物原代培養(yǎng)物中含有各種不同分化的細胞類型，它們的生長速率各不相同，成纖維細胞最易生長，會在此后的傳代培養(yǎng)中占優(yōu)勢。皮膚、雞胚、淋巴、鼠腦等是常用的原代培養(yǎng)物，用于研究、治療和生產(chǎn)疫苗等。2正常細胞正常的原代培養(yǎng)物進行傳代形成繼代培養(yǎng)物，在一定的代數(shù)范圍內(nèi)，它們都是正常細胞。正常動物細胞的特征：①二倍體的染色體互補表明沒有明顯的基因改變；②有限的壽命反映細胞的生長調(diào)節(jié)；③細胞無惡性，表明將該細胞注入免疫抑制動物不能形成腫瘤；④貼壁依賴和密度抑制表明其增殖受到控制，當細胞在介質(zhì)表面生長至匯合單層時增殖就停止。正常細胞系由于安全而被用于人用疫苗的生產(chǎn)。3轉(zhuǎn)化細胞正常細胞在培養(yǎng)中可能獲得無限的增殖能力，成為連續(xù)細胞系。轉(zhuǎn)化伴隨著染色體模式的改變，二倍體變成異倍體。轉(zhuǎn)化發(fā)生的途徑：①自發(fā)轉(zhuǎn)化；②化學轉(zhuǎn)化；③病毒轉(zhuǎn)化；④致瘤因子轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化細胞有無限壽命，培養(yǎng)中更易生長，廣泛用于生產(chǎn)生物制品。4腫瘤細胞來自腫瘤組織的細胞或經(jīng)腫瘤細胞與其他細胞融合產(chǎn)生的細胞。腫瘤細胞生長速率高，對生長因子的以來程度低，對培養(yǎng)環(huán)境的要求不苛刻。第二節(jié)培養(yǎng)基動物細胞能在體外傳代和繁殖，促使找到化學成分更加確定的培養(yǎng)基以維持細胞連續(xù)生長和替代“天然”培養(yǎng)基，如胚胎提取物、蛋白質(zhì)水解物、淋巴液等。常用的Eagle和DMEM培養(yǎng)基如表所示。培養(yǎng)基的設計對細胞培養(yǎng)工程影響：1影響原材料的要求和保存，培養(yǎng)基中含有化學成分不確定的添加物（如血清）或?qū)θ梭w有特殊作用的化合物（如青霉素），會給培養(yǎng)基的質(zhì)量控制和培養(yǎng)上清的下游處理帶來不利影響，甚至造成工藝的失敗。2影響反應器的設計和操作，培養(yǎng)基的黏性（剪切力）和發(fā)泡性（消泡系統(tǒng)）；3影響細胞系的穩(wěn)定性，培養(yǎng)基的理性設計是提高細胞培養(yǎng)密度和產(chǎn)物濃度的重要途徑；4影響產(chǎn)品的質(zhì)量，如有的細胞系會分泌蛋白酶等到培養(yǎng)上清中，水解或修飾產(chǎn)物分子成為低活性或無活性的形式，需在培養(yǎng)基中添加蛋白酶抑制劑；5降低成本。一培養(yǎng)基的物理性質(zhì)（一）pH多數(shù)細胞系在pH7.4生長很好，正常的成纖維細胞系以pH7.4-7.7，轉(zhuǎn)化細胞pH7.0-7.4，上皮細胞以pH5.5最合適。（二）緩沖能力培養(yǎng)基要在兩種條件下具緩沖能力：1開式皿中，CO2的釋放引起pH升高；2高細胞密度下，轉(zhuǎn)化細胞系大量產(chǎn)生CO2和乳酸，引起pH下降。碳酸鹽緩沖系統(tǒng)毒性小、成本低、對培養(yǎng)物有營養(yǎng)作用，常用，但在生理pH下的緩沖能力差。（三）滲透壓多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有很寬的耐受范圍。（四）溫度影響細胞生長低溫CO2溶解度增加，緩沖劑的離子化和pKa的變化，影響pH（五）粘度受血清含量的影響，多數(shù)情況對細胞生長沒影響。在攪拌條件下，用羧甲基纖維素增加培養(yǎng)基的粘度，可減輕細胞損害。（六）表面張力和泡沫培養(yǎng)基的表面張力可用來促進原代外植物貼附到介質(zhì)上。泡沫使蛋白質(zhì)的變形速率增加，如果泡沫達到培養(yǎng)容器的頸部，容易受污染。加入硅油消泡劑降低表面張力，有助于防止泡沫產(chǎn)生。二培養(yǎng)基的組成（一）水高于注射水標準（二）低相對分子質(zhì)量營養(yǎng)物1能源和碳源物質(zhì)主要是糖及糖醇解的產(chǎn)物和谷氨酰胺，多數(shù)培養(yǎng)基以葡萄糖為能源，它主要由糖酵解作用代謝形成丙酮酸，并可轉(zhuǎn)化乳酸或乙酰乙酸進入檸檬酸循環(huán)形成CO2。2碳源（氨基酸），組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是細胞合成復雜含氮化合物的前提和能源物質(zhì)。幾乎所用培養(yǎng)基都含有全部必需氨基酸，根據(jù)需要補充適量非必需氨基酸。增加氨基酸濃度可提高培養(yǎng)的細胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率。3維生素，多形成輔酶或輔基，對細胞的代謝過程有重要影響。4無機離子大宗離子：含量較高，作用：維持膜的勢（Na+,K+），維持滲透壓平衡（Na+,Cl-）,作為酶反應的輔因子（Mg2+），促進細胞貼附（Mg2+,Ca2+），起緩沖作用（HPO42-,HCO3-）。微量元素，為細胞需要（鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅），無蛋白長期培養(yǎng)需要（鈷、鋯、鍺、鎳、錫、鉻）。5脂類和磷脂前體，來源于血清，在無血清培養(yǎng)中，有些細胞需要添加膽固醇、脂肪酸、磷脂等脂類。6核酸前體，核酸（RNA,DNA）前體通常不是培養(yǎng)基的必須成分。（三）非營養(yǎng)性物質(zhì)用來調(diào)節(jié)細胞的物理化學環(huán)境，間接影響細胞的行為。1抗生素，抑制微生物的污染2pH緩沖劑，常用碳酸氫鈉3酚紅，培養(yǎng)基指示劑4保護劑，保護細胞免受由滲透壓變化、剪切、毒性金屬和氧化引起的損傷的物質(zhì)。在生物反應器培養(yǎng)的細胞會受到機械攪拌和起泡運動所產(chǎn)生的剪切損傷，某些大分子化合物（甲基纖維素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、血清蛋白）能夠減輕這種損傷。5還原劑，如β－巰基乙醇在雜交瘤細胞培養(yǎng)中能刺激抗體分泌，促進胱氨酸利用。三血清組織細胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基是血清，因血清含有大量的蛋白質(zhì)、核酸、代謝物、激素等營養(yǎng)物質(zhì)，對促進細胞生長繁殖、黏附和中和某些物質(zhì)的毒性起一定的作用。但血清還含有破碎細胞釋放物質(zhì)（血紅蛋白和血小板的生長因子）、采血中引入的污染物。常用的血清：小牛血清、胎牛血清、馬血清和人血清，最常用：小牛血清、胎牛血清。血清作用：1影響培養(yǎng)基的生理性質(zhì)，如粘度、滲透壓、擴散速度等；2含有蛋白酶抑制劑，抑制消化時用的胰蛋白酶和細胞分泌的蛋白酶；3提供合成培養(yǎng)基中不含有的營養(yǎng)物用于細胞代謝；4提供小分子物質(zhì)的載體蛋白；5提供細胞貼壁必須的因子；6含有酶系，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的成分成為細胞能力用的形式或非毒性形式；7提供微量元素、激素和生長因子；8結(jié)合或中和培養(yǎng)基中的毒性物質(zhì)；9結(jié)合和保護在過量時有毒性的營養(yǎng)物并緩慢釋放；10提供蛋白質(zhì)保護細胞，防止對其它重要因子的非特異性吸附。四無血清和無蛋白培養(yǎng)基使用血清的缺點：1含有微量成分，對細胞生長可能有不同程度的作用；2易受病毒污染，增加不能控制的因素；3對培養(yǎng)細胞有增長抑制作用；4質(zhì)量不穩(wěn)定，標準化困難；5所獲得產(chǎn)品純化困難；6高質(zhì)量血清供應不足。（一）無血清培養(yǎng)基由營養(yǎng)完全的基礎培養(yǎng)基添加經(jīng)驗確定的激素、生長因子、貼壁因子和結(jié)合蛋白而成。具有細胞株特異性、配方保密、價格高。無蛋白培養(yǎng)基，便于產(chǎn)物分離、降低培養(yǎng)基成本，便于培養(yǎng)基的存放、使用和保證生物安全。但設計困難，應用范圍受到限制。（二）無血清培養(yǎng)基的常用添加成分1白蛋白和脂類要求：熱原和游離脂肪酸含量較低，在雜交瘤細胞培養(yǎng)中，白蛋白作為脂肪酸和某些微量元素的載體，還具有脫毒劑的功能。脂類添加對細胞生長的作用因細胞而異，常與白蛋白一起加入或制成微乳，具有較好的使用效果。2胰島素，細胞重要的生長因子，能夠刺激葡萄糖的利用及RNA、蛋白和磷脂的合成。3轉(zhuǎn)鐵蛋白，一種結(jié)合鐵的糖蛋白，重要的生長刺激蛋白。4乙醇胺，一種重要的刺激細胞生長的化合物，與細胞內(nèi)磷脂合成有關，腦磷脂合成的前體。5亞硒酸鈉，提高細胞在無血清培養(yǎng)基中的生長速率6微量元素，支持生長和維持活性7生長因子，8其它添加物，β－巰基乙醇、氫化可的松、VC和抗氧化劑等第三節(jié)細胞培養(yǎng)的基本方法動物細胞培養(yǎng)與微生物細胞的比較（見表）一動物細胞培養(yǎng)的基本工藝分三階段：1準備階段，包括：設備的清洗、消毒，培養(yǎng)基的配制和除菌，細胞種子的復蘇、檢定和擴增。2細胞培養(yǎng)階段，包括細胞接種，培養(yǎng)工藝參數(shù)（溶解氧濃度、pH、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量）的調(diào)整，取樣分析（細胞計數(shù)、存活率分析、營養(yǎng)成分分析、廢產(chǎn)物分析），培養(yǎng)基更換。3產(chǎn)物生產(chǎn)階段，包括培養(yǎng)基更換，病毒準備和接種或產(chǎn)物表達誘導劑的加入，培養(yǎng)上清的收獲，取樣分析（細胞密度、感染率、存活率、產(chǎn)物濃度或滴度、抗原性）。二維持培養(yǎng)和放大培養(yǎng)（一）培養(yǎng)容器多孔板、Petri培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)方瓶，是常用的靜止培養(yǎng)容器，體積小，操作方便。滾瓶：培養(yǎng)條件接近于靜止，體積較大，放大容易，重演性好，培養(yǎng)時放在滾瓶機上緩慢滾動。缺點：勞動強度大，壁表面積小，占用空間大，培養(yǎng)條件難以檢測和控制。轉(zhuǎn)瓶：由磁力驅(qū)動進行溫和攪拌，接種后置于室溫或培養(yǎng)箱培養(yǎng)。生物反應器動物細胞培養(yǎng)對培養(yǎng)容器表面的要求：生物相容性、較高的光潔度、弱電荷和親水性（二）懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)：細胞在培養(yǎng)期中自由懸浮生長的過程，主要用于非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。對設備的要求簡單，有成熟的理論予以指導，并可借鑒微生物發(fā)酵的部分經(jīng)驗和放大規(guī)律。對于小規(guī)模培養(yǎng)可采用轉(zhuǎn)瓶和滾瓶培養(yǎng)，大規(guī)模培養(yǎng)可采用發(fā)酵罐式的細胞培養(yǎng)反應器。懸浮培養(yǎng)的細胞密度較低，轉(zhuǎn)化細胞懸浮培養(yǎng)有潛在致癌危險，培養(yǎng)病毒易失去病毒標記而降低免疫能力，許多動物細胞屬于貼壁依賴性，不能進行懸浮培養(yǎng)。（三）貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)：細胞必須貼附在固體介質(zhì)表面上生長的培養(yǎng)方式，主要用于淋巴組織和許多異倍體等貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。是動物細胞培養(yǎng)的一種重要方式。貼壁培養(yǎng)過程，貼壁依賴性細胞需附著在帶適量正電荷或半固體的表面上，原來是圓形的細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展開來，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。一般可在數(shù)天鋪滿生長表面，形成致密的細胞單層。培養(yǎng)貼壁依賴性細胞最初采用滾瓶系統(tǒng)，后來采用微載體系統(tǒng)。采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁依賴性細胞，細胞可貼附在微載體上，懸浮于培養(yǎng)基中，逐漸生長成單層。該系統(tǒng)優(yōu)點：比表面積大，容易控制和檢測細胞的生長情況、培養(yǎng)基利用率高、采樣重復性好。收獲過程簡單、放大容易、勞動強度小、占用空間小等。細胞貼壁過程：貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細胞與表面接觸、細胞貼壁于培養(yǎng)表面和貼壁細胞在培養(yǎng)表面上擴散（如圖）。（四）微載體微載體：直徑60－250μm且適合于動物細胞貼附和生長的微珠。優(yōu)點：1比表面積大；2可采用均勻懸浮培養(yǎng)，簡化檢測和控制，提高培養(yǎng)系統(tǒng)的重演性；3容易放大；4適合多種細胞貼壁依賴性培養(yǎng)；5可用顯微鏡觀察細胞的生長情況；6收獲容易。缺點：1易受剪切損傷，不適合貼壁不牢的細胞生長；2價格貴，不能重復利用；3需較高的接種量。微載體具備的條件：1生物相容性，表面親水，不含毒害細胞的成分，細胞容易貼壁；2密度大于培養(yǎng)基；3粒徑60－250μm，粒度均勻，表面光滑；4光學性質(zhì)良好；5耐高溫滅菌；6基質(zhì)材料非剛性，減少相互碰撞損傷；7不會有影響產(chǎn)物分離純化的物質(zhì)溶入培養(yǎng)基；8價廉。合成微載體的原料：葡聚糖、塑料、明膠、纖維素、殼聚糖、玻璃等。（五）動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝將組織切成碎片，然后用溶解蛋白質(zhì)的酶處理而得到單個細胞，離心收集細胞。將細胞植入營養(yǎng)培養(yǎng)基，使細胞在培養(yǎng)基中增殖到覆蓋瓶壁表面，用酶把細胞從瓶壁上消化下來，接種到若干培養(yǎng)瓶中進行擴養(yǎng)，將培養(yǎng)所得的細胞種子冷藏于液氮中，從液氮中取出一部分細胞種子進行解凍、復活培養(yǎng)，進行擴大培養(yǎng)已獲得足夠的細胞量，將細胞接種于大規(guī)模生物反應器中進行培養(yǎng)，按照產(chǎn)物的不同形式進行產(chǎn)物分離純化。對胞內(nèi)產(chǎn)物，收集細胞進行破碎，經(jīng)分離純化獲得產(chǎn)物；對胞外產(chǎn)物，通過濃縮、純化培養(yǎng)液獲得產(chǎn)品；對需加入誘導劑進行培養(yǎng)或病毒感染培養(yǎng)才能得到產(chǎn)物的細胞，可加入誘導劑或病毒感染后，收集細胞，經(jīng)分離純化得到產(chǎn)物。三細胞的保存短期保存：低溫冰箱（－70℃），長期保存：液氮（－196℃）。在冷凍和復蘇過程中為減少細胞的損傷，需在細胞冷凍液中加二甲基亞砜（DMSO）或甘油等保護劑，選擇最佳的冷凍和凍融速率。冷凍，細胞經(jīng)胰蛋白酶消化分散，細胞用冷凍液（含培養(yǎng)基、血清、保護劑）配成2－5×106cells/L，分裝于細胞冷凍保存管，冷凍速率1℃/min。程序化冷凍復蘇，采用快速解凍，從液氮罐取出所要的冷凍管，直接放入37℃水浴中，無菌打開冷凍管，離心去除冷凍液，換用生長培養(yǎng)基培養(yǎng)。四動物細胞培養(yǎng)技術（一）分批式培養(yǎng)將細胞核培養(yǎng)液一次性裝入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)，細胞不斷生長，同時產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，終止培養(yǎng)。在細胞分批培養(yǎng)過程中，不向培養(yǎng)系統(tǒng)補加營養(yǎng)物質(zhì)，而只向培養(yǎng)基中通入氧，能過控制的參數(shù)只有pH、溫度和通氣量，因此細胞所處的生長環(huán)境隨著營養(yǎng)物的消耗和產(chǎn)物、副產(chǎn)物的積累時刻都在發(fā)生變化，不能使細胞自始至終處于最優(yōu)的條件，因而分批培養(yǎng)并不是一種很好的培