劉闖、魏巍、喬艷、蘇瑞銳

摘要：SPR技術(shù)作為檢測(cè)，分析生物分子互相作用有效工具，有些國(guó)家已經(jīng)生產(chǎn)出成熟商業(yè)化SPR傳感系統(tǒng)。對(duì)SPR生物傳感器工作原理，應(yīng)用領(lǐng)域，最新進(jìn)展作出闡述，并對(duì)其在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用和研究發(fā)展前景進(jìn)行了討論。

引言：表面等離子共振技術(shù)（surfaceplasmonresonancetechnology，SPR）是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)一種生物分子檢測(cè)技術(shù)，是基于SPR檢測(cè)生物傳感芯片（biosensorchip）上配位體與分析物作用一種前沿技術(shù)，在20世紀(jì)初，Wood觀測(cè)到持續(xù)光譜偏振光照射金屬光柵時(shí)浮現(xiàn)了反常衍射現(xiàn)象，并且對(duì)這種現(xiàn)象進(jìn)行了公開描述。1941年，F(xiàn)ano用金屬與空氣界面表面電磁波激發(fā)模型對(duì)這一現(xiàn)象給出理解釋。1957年，Ritchie發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電子穿過(guò)金屬薄片時(shí)存在數(shù)量消失峰。她將這種消失峰稱之為“能量減少”等離子模式，并指出了這種模式和薄膜邊界關(guān)系，第一次提出了用于描述金屬內(nèi)部電子密度縱向波動(dòng)“金屬等離子體”概念。2年后，Powell和Swan用實(shí)驗(yàn)證明了Ritche理論。隨后，Stem和Farrell給出了這種等離子體模式共振條件，并將其稱為“表面等離子共振技術(shù)（surfaceplasmonresonance，SPR）”。1968年，Otto和Kretschmann等人研究了金屬和介質(zhì)界面用光學(xué)方式激發(fā)SPR問(wèn)題。并分別設(shè)計(jì)了兩種棱鏡耦合方式。此后，SPR技術(shù)獲得了長(zhǎng)足發(fā)展。1990年，國(guó)際上第一臺(tái)商業(yè)生產(chǎn)生物傳感器在瑞典Biocore公司誕生。實(shí)踐證明，SPR傳感器與老式檢測(cè)手段比較，具備無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，敏捷度高等突出長(zhǎng)處。因此，在醫(yī)學(xué)診斷，生物監(jiān)測(cè)，生物技術(shù)，藥物研制和食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域有遼闊應(yīng)用前景。

基本原理

1消失波，在波動(dòng)光學(xué)沒有發(fā)展起來(lái)此前，菲涅爾定理較好地描述了光在介質(zhì)表面行走途徑。（n1sinθ1=n2sinθ2），可以看出，當(dāng)光從光密介質(zhì)入射到光疏介質(zhì)時(shí)（n1>n2）就會(huì)有全反射現(xiàn)象產(chǎn)生。但以波動(dòng)光學(xué)角度來(lái)重新研究全反射時(shí)候就會(huì)發(fā)現(xiàn)，全反射光波會(huì)透過(guò)光疏介質(zhì)約為光波波長(zhǎng)一種深度，再沿界面流動(dòng)約半個(gè)波長(zhǎng)再返回光密介質(zhì)。光總能量沒有發(fā)生變化。透入光疏介質(zhì)光波成為消失波。

圖2消失波在界面?zhèn)鞑?表面等離子波；等離子體普通是指由密度相稱高自由正、負(fù)電荷構(gòu)成氣體，其中正、負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等，內(nèi)部不形成空間電荷。如果把金屬價(jià)電子當(dāng)作是均勻正電荷背景下運(yùn)動(dòng)電子氣體，這事實(shí)上也是一種等離子體。當(dāng)金屬受到電磁干擾時(shí)，金屬中電子密度分布就會(huì)變得不均勻。設(shè)想在某一區(qū)域電子密度低于平均密度，那么就會(huì)形成局部正電荷過(guò)剩。這時(shí)由于庫(kù)侖引力作用，會(huì)把近鄰電子吸引到該區(qū)域，而被吸引電子由于獲得附加動(dòng)量，又會(huì)使該區(qū)域匯集過(guò)多負(fù)電荷,然而，由于電子間排斥作用，使電子再度離開該區(qū)域，從而形成價(jià)電子相對(duì)于正電荷背景起伏振蕩。由于庫(kù)侖力長(zhǎng)程作用，這種局部電子密度振蕩將形成整個(gè)電子系統(tǒng)縱向集體振蕩，并以密度起伏波形式來(lái)體現(xiàn)?？芍饘僦袃r(jià)電子相稱于正離子背景這種振蕩與導(dǎo)電氣體中檔離子振蕩相似，故稱為金屬中等離子振蕩。表面等離子振蕩也是如此，咱們可以當(dāng)作其內(nèi)部也有一定電子振蕩波存在。3當(dāng)光線在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí)，會(huì)在金屬膜中產(chǎn)生消失波，消失波與表面等離子波發(fā)生共振時(shí)，檢測(cè)到反射光強(qiáng)會(huì)大幅度地削弱。能量從光子轉(zhuǎn)移到表面等離子，入射光大某些能量被表面等離子波吸取，使得反射光能量急劇減少。因而，可以反射光強(qiáng)響應(yīng)曲線看到一種最小尖峰，此時(shí)相應(yīng)入射光波長(zhǎng)為共振波長(zhǎng)，相應(yīng)入射角為共振角。SPR角隨金表面折射率變化而變化，而折射率變化又與金表面結(jié)合分子質(zhì)量成正比。這就是SPR對(duì)物質(zhì)結(jié)合檢測(cè)基本原理。SPR傳感系統(tǒng)普通是由光學(xué)系統(tǒng)，老式系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)這3某些構(gòu)成。其中，光學(xué)系統(tǒng)涉及光源和光路，用以產(chǎn)生合乎性能規(guī)定入射光；傳感系統(tǒng)運(yùn)用上述原理將待測(cè)信息轉(zhuǎn)換為敏感膜折射率變化，并通過(guò)光學(xué)耦合轉(zhuǎn)換為共振角或共振波長(zhǎng)變化；檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)反射光發(fā)光強(qiáng)度，記錄共振吸取峰位置，當(dāng)入射波以某一角度或某一波長(zhǎng)入射，近場(chǎng)波矢K和SPW波矢相等，發(fā)生諧振，入射光能量耦合到SPW波，反射光強(qiáng)度浮現(xiàn)一種凹陷。此時(shí)入射光角度稱為SPR角。SPR角隨金表面折射率變化而變化，而折射率變化又與金表面結(jié)合分子質(zhì)量成正比

圖3SPR檢測(cè)原理當(dāng)入射波以某一角度或某一波長(zhǎng)入射，近場(chǎng)波矢K和SPW波矢相等，發(fā)生諧振，入射光能量耦合到SPW波，反射光強(qiáng)度浮現(xiàn)一種凹陷。此時(shí)入射光角度稱為SPR角。SPR角隨金表面折射率變化而變化，而折射率變化又與金表面結(jié)合分子質(zhì)量成正比.(生物秀實(shí)驗(yàn)頻道

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儀器工作原理：

以瑞典Biacore3000型SPR儀為例，簡(jiǎn)介這種儀器工作原理。Biacore3000由工作單元和一臺(tái)安裝有BiacoreControl軟件電腦構(gòu)成。工作單元又分為液體解決單元和光學(xué)系統(tǒng)。

Biacore3000工作單元由如下6某些構(gòu)成

兩個(gè)液體傳送泵：其中一種泵負(fù)責(zé)保持穩(wěn)定流速液體流過(guò)傳感芯片表面，另一種泵負(fù)責(zé)自動(dòng)自動(dòng)進(jìn)樣裝置中樣品傳送自動(dòng)上樣裝置(autosampler)：負(fù)責(zé)樣品混合、注射和回收。

一體化U型射流器（Integratedu-FluidicCartridge，IFC）：包括液體傳送通道，樣品環(huán)和閥門。

檢測(cè)單元：涉及可以產(chǎn)生和測(cè)量SPR信號(hào)光電組分。

四個(gè)可探測(cè)液體池(flowcell)：該液體池通過(guò)將IFC靠在傳感芯片上而形成。

微解決裝置(microprocessors)：它能控制泵，自動(dòng)上樣裝置，和IFC閥門并且能對(duì)SPR信號(hào)作基本解決。

傳感芯片插入檢測(cè)單元芯片盒中，引入（dock）儀器后于IFC共同形成液體池。IFC通過(guò)連接塊與緩沖液相連。連接塊上有注射口，通過(guò)注射口可以將樣品加載到IFC上。

溫度控制

SPR信號(hào)對(duì)于溫度變化非常敏感，因此在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持傳感芯片表面溫度恒定是非常重要Biacore3000采用Peltier元件來(lái)控制傳感芯片表面溫度。會(huì)不斷閃爍。如果溫度不穩(wěn)定，儀器前部面板上黃色LED（light-emittingdiode通過(guò)預(yù)先設(shè)定，咱們可以把溫度控制在4-40oC之間任意一點(diǎn)（不能比環(huán)境溫度低20度）(生物秀實(shí)驗(yàn)頻道

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LED狀態(tài)批示器

儀器前部面板上有5個(gè)LED狀態(tài)批示器：

Ready(green):燈亮表達(dá)電源打開，儀器準(zhǔn)備就緒。

Error（red）：燈亮表達(dá)儀器浮現(xiàn)問(wèn)題，當(dāng)電源打開時(shí)，此燈亮幾秒鐘，如果在其她狀況下亮起都闡明儀器浮現(xiàn)了嚴(yán)重問(wèn)題。

Temperature（yellow）：燈光穩(wěn)定代表溫度穩(wěn)定，燈光閃爍闡明溫度不穩(wěn)定。

Sensorchip（green）：燈光穩(wěn)定代表傳感芯片安裝到位，燈光閃爍表白未安裝傳感芯片或安裝不到位，浮現(xiàn)錯(cuò)誤。

Run（green）：儀器在工作時(shí)此批示燈亮起。SPR儀傳感芯片

應(yīng)用于SPR儀傳感芯片（sensorchip）有兩個(gè)基本特性：一方面是傳感芯片玻璃表面覆蓋有薄薄金層，這是產(chǎn)生SPR信號(hào)所必須條件，是探測(cè)生物分子間互相作用基本；此外一種特性是，在金層上面又有一種覆層，這種覆層不影響SPR效應(yīng)，可以連接配體并為所要研究分子互相作用提供適當(dāng)環(huán)境。為以便起見普通咱們把連接在傳感芯片上分子稱為配體（ligand），把代測(cè)分子稱為分析物（analyte）。

傳感芯片表面金層和其上覆層是很穩(wěn)定，它可以耐受極端PH和許多中檔濃度有機(jī)試劑。一旦配體被固定在傳感芯片上之后，傳感芯片對(duì)于各種試劑和條件耐受限度就重要取決于所連配體性質(zhì)。傳感芯片自身鑲嵌在塑料載體上，并有一種塑料鞘，以以便使用。

圖7傳感芯片示意圖SPR是入射光衰勢(shì)波與介質(zhì)表面等離子波形成共振，只要能到達(dá)到共振就能有spr現(xiàn)象產(chǎn)生，因此依照SPR有4種分析辦法

1角度調(diào)制法：固定入射光波長(zhǎng)，變化入射角度，觀測(cè)到反射光歸一化強(qiáng)度

2波長(zhǎng)調(diào)制法：固定入射光角度，變化入射光波長(zhǎng)，觀測(cè)入射光歸一化強(qiáng)度

3強(qiáng)度調(diào)制法：如射光角度和波長(zhǎng)都固定，憑借強(qiáng)度變化測(cè)量折射率變化

4相位調(diào)制法：入射光角度和波長(zhǎng)都固定，觀測(cè)反射光和入射光相差。

美國(guó)熱電公司分子光譜部以其傅立葉變換紅外技術(shù)經(jīng)驗(yàn)結(jié)合最新SPR技術(shù)推出了嶄新FT-SPR檢測(cè)模塊-SPR100，與角度掃描型SPR檢測(cè)技術(shù)不同，SPR-100特性是在SPR檢測(cè)體系中固定入射光角度，當(dāng)在某一特定波長(zhǎng)發(fā)生等離子共振現(xiàn)象時(shí)，入射p-偏振光能量幾乎被完全吸取，從而檢測(cè)到金屬表面分子間互相作用。光纖藕合構(gòu)造SPR傳感器采用光纖作為光傳播媒質(zhì).由于光纖特殊性,這種傳感器具備其她構(gòu)造所沒有特點(diǎn):它可以很以便地探測(cè)某些人類難以進(jìn)入或者有害地方,可以通過(guò)光線對(duì)敏感信號(hào)傳播,實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程檢測(cè)和分布式檢測(cè),并且也可以達(dá)到較高敏捷度.光纖藕合傳感器一般是將普通光纖某些保護(hù)層剝離,將纖芯裸露出來(lái),再在纖芯外包裹金屬膜層及敏感層,檢測(cè)時(shí),將該某些與樣液接觸。從而實(shí)現(xiàn)以便敏捷檢測(cè)。

SPR檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)儀器重要作用于生物特異互相作用分析，與老式互相作用技術(shù)如超速離心，熒光法，熱量測(cè)定法等相比，具備檢測(cè)過(guò)程以便快捷，敏捷度高；無(wú)需標(biāo)記樣品，保持了分子活性；樣品需要很少；大多數(shù)狀況下,不需要對(duì)樣品進(jìn)行解決；高通量，高質(zhì)量分析數(shù)據(jù)；能在混濁甚至不透明樣品中進(jìn)行等特點(diǎn)，所以在檢測(cè)領(lǐng)域有著更加遼闊應(yīng)用。

Karlsoon等應(yīng)用SPR檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)生物特異互相作用分析進(jìn)行了單克隆抗體－抗原互相作用動(dòng)力學(xué)研究，Mackenzie等用生物特異互相作用分析進(jìn)行了細(xì)菌毒素對(duì)糖脂受體親和力和特異性定量分析。

SPR生物傳感器應(yīng)用

自Liedberg等于1983年初次運(yùn)用SPR技術(shù)進(jìn)行抗原抗體互相作用分析以來(lái)，SPR生物傳感器技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，受體/配體，抗體/抗原分子垂釣，免疫辨認(rèn)，癌癥研究和新藥篩選等生命科學(xué)領(lǐng)域，用于實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-核酸，新藥分子-靶蛋白等生物分子互作過(guò)程。特別是1990年，商業(yè)化SPR應(yīng)用以來(lái)，SPR生物傳感器從主線上變化了生物分子辨認(rèn)科學(xué)，成為生命科學(xué)和制藥研究上原則工具。此外在食品，環(huán)境科學(xué)，臨床診斷，基因測(cè)序，疾病治療，案件偵破，興奮劑檢測(cè)等應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)展。（1）在檢測(cè)方面，重要應(yīng)用于物理量檢測(cè)，化學(xué)檢測(cè)和生物檢測(cè)。物理量檢測(cè)上，重要運(yùn)用SPR傳感器技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)濕度傳感系統(tǒng)及基于氫化無(wú)定型硅熱光效應(yīng)溫度系統(tǒng)。化學(xué)檢測(cè)上，重要運(yùn)用SPR傳感器通過(guò)檢測(cè)共振角或共振波長(zhǎng)變化來(lái)檢測(cè)待測(cè)分子成分，濃度及參加化學(xué)反映特性。生物檢測(cè)上，重要用于檢測(cè)生物分子結(jié)合伙用或者通過(guò)生物分子結(jié)合伙用檢測(cè)來(lái)完畢特定生物分子辨認(rèn)及其濃度測(cè)定，例如初期抗原-抗體互相作用，streptatividin和維生素H互相作用及某些IgG檢測(cè)。近年來(lái)，還涉及到蛋白質(zhì)之間或者蛋白質(zhì)與DNA互相作用檢測(cè)以及蛋白質(zhì)構(gòu)造變化檢測(cè)，抗腫瘤蛋白APC生物化學(xué)屬性檢測(cè)，酶蛋白與單克隆抗體動(dòng)態(tài)反映過(guò)程檢測(cè)，尚有細(xì)胞色數(shù)C，葡萄糖，機(jī)球素，鐵蛋白，香煙中煙堿，破傷風(fēng)毒素，艾滋病檢測(cè)等。近年來(lái)，還浮現(xiàn)了運(yùn)用SPR檢測(cè)辦法來(lái)監(jiān)測(cè)酶促反映動(dòng)態(tài)過(guò)程。（2）藥物篩選。SPR技術(shù)因其實(shí)時(shí)，高通量，特異性及能在天然狀態(tài)下研究藥物分子與靶點(diǎn)互相作用，為新藥研發(fā)提供了有力工具。在藥物篩選，藥物分子靶點(diǎn)鑒定及先導(dǎo)藥物化合物構(gòu)造優(yōu)化方面有著廣泛應(yīng)用。當(dāng)前發(fā)展中藥物篩選生物傳感器測(cè)試涉及兩方面內(nèi)容，一是從文庫(kù)中篩選與靶蛋白結(jié)合化合物；二是進(jìn)行普通ADME實(shí)驗(yàn)。（3）蛋白質(zhì)組學(xué)。SPR技術(shù)因其高效敏捷無(wú)需額外標(biāo)記等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用與蛋白質(zhì)檢測(cè)和蛋白-蛋白互相作用等蛋白質(zhì)組學(xué)研究，它能在保持蛋白質(zhì)天然狀態(tài)狀況下實(shí)時(shí)提供靶蛋白細(xì)胞器分布，結(jié)合動(dòng)力學(xué)及濃度變化等功能信息，為蛋白質(zhì)組研究開辟了全新模式。（4）臨床診斷。運(yùn)用生物傳感器鑒定和評(píng)價(jià)潛在疫苗組分，監(jiān)測(cè)和定量測(cè)定病人血清中生物藥劑和抗體滴度可行性，跟蹤檢測(cè)動(dòng)物模型，人類臨床實(shí)驗(yàn)和各種臺(tái)式應(yīng)用中生物反映物（5）食物檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)控。生物傳感器已經(jīng)應(yīng)用于測(cè)定食物中營(yíng)養(yǎng)物和抗生素水平，食品中細(xì)菌和真菌污染量以及空氣或水中傳播毒素，殺蟲劑和除草劑。生物傳感器在線分析能力和高敏捷度，微量樣品需求特點(diǎn)，使得這種儀器成為食品及環(huán)境安全監(jiān)控抱負(fù)工具。（6）細(xì)胞膜模仿。生物傳感器金屬表面能天然模仿細(xì)胞膜組分與可溶性分析物互相作用。大量文獻(xiàn)簡(jiǎn)介了運(yùn)用Biacore疏水性HPA或親脂性L1傳感器芯片構(gòu)建雜交脂雙層，進(jìn)行膜模仿研究工作，這些芯片表面穩(wěn)定性和可重復(fù)性使藥物，抗體和蛋白結(jié)合到脂膜定性和半定量分析成為也許。（7）遺傳分析。SPR生物傳感器用于遺傳分析是一種嶄新領(lǐng)域。如用于檢測(cè)點(diǎn)突變，用于檢測(cè)區(qū)別野生和經(jīng)遺傳修飾大豆基因序列等?？傊S著生物傳感器芯片技術(shù)，實(shí)驗(yàn)辦法及數(shù)據(jù)分析技術(shù)不斷發(fā)展，SPR生物傳感器應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒉粩鄶U(kuò)大，技術(shù)水平及實(shí)用限度將不斷提高，有著非常遼闊應(yīng)用前景。

將來(lái)展望

生物分子之間互相作用是生命現(xiàn)象發(fā)生基本，研究生物分子之間互相作用可以闡明生物反映機(jī)理，揭示生命現(xiàn)象本質(zhì)。近年來(lái)，研究分子互相作用技術(shù)不斷浮現(xiàn)，其中表面等離子共振在生物學(xué)以及有關(guān)領(lǐng)域研究應(yīng)用獲得了很大進(jìn)展，SPR技術(shù)可以現(xiàn)場(chǎng)，實(shí)時(shí)地測(cè)定生物分子間互相作用而無(wú)需標(biāo)記，可以持續(xù)監(jiān)測(cè)吸附和解離過(guò)程，并可以進(jìn)行各種成分互相租用研究。

如今，SPR技術(shù)已被廣泛地用來(lái)分析生物分子如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，藥物-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-核酸，核酸-核酸之間互相作用反映動(dòng)力學(xué)，結(jié)合位點(diǎn)和反映物濃度等信息，所涉及研究領(lǐng)域涉及免疫辨認(rèn)，信號(hào)傳導(dǎo)，藥物篩選，抗體定性以及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化等，SPR技術(shù)在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用范疇非常廣，在研究基因工程載體與質(zhì)粒DNA之間互相作用，以評(píng)價(jià)載體效率，DNA序列特異性抗體性質(zhì)鑒定等方面，SPR技術(shù)都發(fā)揮了重要作用。SPR技術(shù)與其她分析技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，必將加速分子生物學(xué)研究進(jìn)展，使咱們對(duì)生命現(xiàn)象理解更加進(jìn)一步。(生物秀實(shí)驗(yàn)頻道

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參照文獻(xiàn)

1笑梅；高等儀器分析實(shí)驗(yàn)與技術(shù)；北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社（）

2段媛媛，劉德立。SPR生物傳感器特點(diǎn)及其在生物特異性互相分析中應(yīng)用。生物技術(shù)通訊，，13（1）：72-75

3王海明，錢凱先.表面等離子共振技術(shù)在生物分子互相作用研究中應(yīng)用.浙