65.020.30CCS

B

4415 DB15/T

3359—2024綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程Technical

code

on

sheep2024-02-23

發(fā)布 2024-03-23

實施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB15/T

3359—2024 本文件按照GB/T

1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則

第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會（SAM/TC

19）歸口。本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古賽諾種羊科技有限公司。怡靜。DB15/T

3359—20241 范圍本文件規(guī)定了綿羊體外胚胎生產(chǎn)過程中的卵母細胞體外成熟、體外受精和早期胚胎體外培養(yǎng)等內(nèi)容。本文件適用于綿羊體外胚胎生產(chǎn)程序。2 規(guī)范性引用文件文件。NY/T

1571羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。體外成熟 in

vitro

maturation（）卵母細胞在體外恢復(fù)減數(shù)分裂并發(fā)育到第二次減數(shù)分裂中期（MII）這一過程，經(jīng)歷細胞核成熟和細胞質(zhì)成熟。體外受精 in

vitro

fertilization（IVF）哺乳動物的精子和卵子置于適宜的培養(yǎng)條件下使之完成受精的一種技術(shù)。體外培養(yǎng) in

vitro

（）將受精卵置于適宜的培養(yǎng)條件下使其發(fā)育至囊胚期。4 體外胚胎生產(chǎn)培養(yǎng)液配制采卵液、體外成熟培養(yǎng)液（IVM液）、受精液（IVF液）和胚胎發(fā)育液（IVC液）配方見附錄A。5 操作前準備DB15/T

3359—2024打開實驗室和超凈工作臺紫外燈，照射

后用酒精擦拭消毒；關(guān)閉實驗室紫外燈

后，操作人員將雙手清洗干凈后，穿戴工作服、口罩、手套、帽子等，更換拖鞋進入實驗室，并隨手關(guān)閉實驗室門；用

酒精噴灑消毒雙手；實驗室工作臺、顯微鏡以及加熱臺面用酒精擦拭消毒，并且將加熱臺打開預(yù)熱。6 卵母細胞體外成熟準備工作6.1.1 揀卵針用酒精燈將采卵用玻璃管拉制成口徑適宜的撿卵針，管口在火焰上燒圓鈍。6.1.2 制作成熟液滴實驗開始前使用

35

mm

培養(yǎng)皿制作卵母細胞成熟液滴（100

μL

成熟液滴，覆蓋

3.5

并放入

5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)平衡

2

h

以上。檢卵采卵液于

℃恒溫板上提前預(yù)熱。將含有卵母細胞的采卵液置入

60

mm

的培養(yǎng)皿。在體式顯微鏡下從左到右、從上到下的順序仔細挑選，將撿出的卵母細胞放置于盛有采卵液的

35

mm

培養(yǎng)皿中，用成熟液洗滌

3

次。7 體外成熟將洗滌好的卵母細胞按

枚/100

20

枚/100

液滴的密度，移入成熟液滴中，后放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)

22

h～

h。培養(yǎng)條件：5%CO2、空氣、38.6

℃、飽和濕度。8 卵母細胞體外受精準備工作體外受精實驗開始前，在

5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，平衡受精液（IVF

液）2

h～3

h；38.6

℃預(yù)熱0.2%的透明質(zhì)酸酶工作液。體外受精8.2.1 精液選擇選擇體外受精效果好的精液，并根據(jù)體外成熟卵母細胞的數(shù)量計算所需的精液量。8.2.2 精液解凍如使用冷凍精液，將所需精液置于

40

8.2.3 精液檢查取約

3

μL

精液置于載玻片上，蓋上蓋玻片后，顯微鏡下檢查精子活力和密度。胞后吹出精液，精液濃度調(diào)整至

110

個/mL～1胞后吹出精液，精液濃度調(diào)整至

110

個/mL～110

個/mL，后置于

38.6

℃

、5%

2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育

208.2.4精子上游將試管架置于

℃加熱臺上，移液槍吸取約

100

μL

精液，緩慢注入裝有

μL

受精液的試管底部，后置于

38.6

℃、

CO2培養(yǎng)箱內(nèi)上游

30

min。卵母細胞處理將體外成熟培養(yǎng)

22

h～

h

的卵母細胞取出，觀察卵母細胞成熟情況，記錄卵丘細胞擴展情況；用移卵針將全部卵母細胞移入預(yù)熱的

0.2%

2～3

層卵丘細胞，使用受精液洗滌

3

次。將洗滌后的卵母細胞按

50

枚/500

μL～

枚/500

μL

受精液（四孔板）或

15

枚/100

枚/100

μL

受精液的密度移入受精液中。體外受精將上游

30

min

后的精液從培養(yǎng)箱中取出，用移液槍沿試管壁從每管上游液中吸取

μL～μL

上清液加入提前預(yù)熱好的離心管中，1500

離心

4

min

后棄掉上清液，剩余約

μL～50

μL精子沉淀液，輕輕混勻。用移液槍吸取精子沉淀液，傾斜槍頭從邊緣插入受精液滴或孔，對準卵母細6 7h。9 體外培養(yǎng)預(yù)先將綿羊胚胎體外發(fā)育液（

液）在

38.6

5%

培養(yǎng)箱中平衡

2

h

以上。將體外受精20

h

后的胚胎取出置于

液內(nèi)，移液槍輕吹以去除黏附的精子及全部卵丘細胞，使用

IVC

液洗滌

3次并對受精卵進行選擇（淘汰胞質(zhì)不均勻、胞質(zhì)發(fā)黑及死卵），之后按

50

枚/500

枚/500

μLIVC

液（四孔板）或

15

枚/100

枚/100

μL

液的密度移入

液中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：90%N2、5%

O2、5%

2、38.6

℃、飽和濕度。胚胎發(fā)育鑒定受精后第

h

統(tǒng)計卵裂率（卵裂的個數(shù)/總卵母細胞數(shù)）；受精后第

168

h

統(tǒng)計囊胚率（囊胚的個數(shù)/卵裂的個數(shù)）。發(fā)育至囊胚階段的胚胎用于冷凍保存或胚胎移植。10 記錄態(tài)，將其分為A、B、C級）、退化卵數(shù)（胞質(zhì)不均勻、卵丘擴散嚴重、裸卵數(shù)）；記錄卵母細胞成熟時間、培養(yǎng)的卵母細胞數(shù)量、卵丘擴展情況、卵裂率、囊胚率。DB15/T

3359—2024

附 錄 A（資料性）體外胚胎生產(chǎn)培養(yǎng)液配制A.1 卵母細胞體外成熟液配制0.02

IU/mL

、0.02

IU/mL

LH、1

μg/mL

E2、

mmol/L半胱胺、10

-7

褪黑素、

FBS、0.1

ml青鏈霉素合劑，使用培養(yǎng)基定容至10

mL

0.22

μm的過濾器過濾，在0

5

℃條件下可保存2A.2 采卵液配制0.05

g

、0.035

g肝素鈉、

青鏈霉素合劑，使用PBS定容至50

mL，混勻后用Millipore0.22

0

℃～5

℃條件下可保存2周。A.3 SOF

液配制3.1452

g

NaCl、

g

KCl、0.0814

g

KH2PO4、0.0442

g

MgSO4、丙酮酸鈉、1.3115g

CaCl2、

g肌醇、0.0074

g谷氨酰胺、300

μL乳酸鈉、

mL青鏈霉素合劑、1%酚紅，使用胚胎水定容至50

，混勻后用Millipore

0.22

0

℃～5

℃條件下可保存2周。A.4 受精液(IVF

液)配制1

mL發(fā)情羊血清、6

IU/ml肝素鈉,

使用液定容至50

mL，混