《第3章基因工程》第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具必會知識考點梳理拓展延伸易錯警示必會知識一基因工程的概念和誕生1．基因工程的概念：基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。2．對基因工程概念的理解基因工程的別名基因剪切拼接技術(shù)、重組DNA技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作環(huán)境主要在生物體外操作對象基因(DNA)操作水平DNA分子水平基本程序剪切→拼接→導入→表達結(jié)果創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品原理基因重組特點定向改造生物遺傳特性；徹底打破種間界限必會知識二基因工程的基本工具基因工程的操作過程至少需要三種“分子工具”：限制性內(nèi)切核酸酶(準確切割DNA分子的“分子手術(shù)刀”)、DNA連接酶(將DNA片段再連接起來的“分子縫合針”)、載體(將體外重組好的DNA分子導入受體細胞的“分子運輸車”)。1．限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”：切割DNA分子的工具是限制性內(nèi)切核酸酶，又稱限制酶。(1)來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。(2)作用特點①切割外源DNA，對自身的DNA不起作用，從而達到保護自身的目的。②專一性：能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。(3)作用結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式—黏性末端和平末端。①黏性末端：錯位切，在識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA分子的兩條鏈分別切開，產(chǎn)生的是黏性末端，如下圖。②平末端：平切，沿著識別序列的中心軸線切開，產(chǎn)生的是平末端，如下圖。2．DNA連接酶——“分子縫合針”：將切下來的DNA片段拼接成新的DNA分子，依靠的是DNA連接酶。(1)DNA連接酶的作用：連接兩個DNA片段的末端，拼接成新的DNA分子。(2)DNA連接酶的種類和特點種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體特點只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端連接起來既能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，也能連接雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端的效率相對較低(3)作用實質(zhì)：DNA連接酶能將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵。3．基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”：要將外源基因送入受體細胞，還需要有運輸工具，這就是“分子運輸車”，又叫載體(或運載體)。(1)載體的作用：一是作為運載工具，與外源基因(即目的基因)的DNA片段結(jié)合，將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中；二是在受體細胞內(nèi)對目的基因進行大量的復制。(2)常用的載體：①最常用的載體是質(zhì)粒。②其他載體：噬菌體、動植物病毒等。(3)需具備的條件①能在受體細胞中穩(wěn)定保存并復制。②具有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段插入。③具有標記基因，便于篩選含重組DNA分子的細胞。④對受體細胞無害，不影響受體細胞正常的生命活動。(4)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與特點①質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。②質(zhì)粒的來源：質(zhì)粒存在于細菌和酵母菌等生物細胞中，最常用的是大腸桿菌質(zhì)粒。③質(zhì)粒的本質(zhì)：環(huán)狀DNA分子，其基因?qū)儆诩毎|(zhì)基因。④質(zhì)粒作為載體的原因：質(zhì)粒DNA分子有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段插入其中；攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進入受體細胞后，能在細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制；質(zhì)粒上常有特殊的標記基因，便于重組DNA分子的篩選；質(zhì)粒不影響受體細胞正常的生命活動。必會知識三DNA的粗提取與鑒定1．實驗原理：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。(1)DNA的溶解性①DNA不溶于酒精，但是細胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精(利用這一原理，可初步分離DNA與蛋白質(zhì))。②DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCI溶液中溶解度不同(利用這一特點，選擇適當濃度的NaCl溶液就能使DNA充分溶解，從而使雜質(zhì)沉淀：或者讓其他成分溶解而使DNA析出，以達到分離的目的)。(2)DNA的鑒定原理：在沸水浴的條件下，DNA與二苯胺試劑反應(yīng)呈現(xiàn)藍色。2．方法步驟(1)實驗材料的選?、僭瓌t上凡是含有DNA的生物材料都可以用于提取DNA，但是，不同生物的組織中DNA含量不同。選用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。②在選取材料時，應(yīng)本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。③取材時要注意安全問題，并注意保護環(huán)境，不要將珍稀、瀕危的生物作為實驗材料。(2)通過研磨釋放DNA：稱取約30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨(可加入少量石英砂助研)。(3)用預冷的酒精溶液提取DNA①在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液，也可以直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。②在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數(shù)為95%)，靜置2～3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分：或者將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。(4)二苯胺鑒定DNA分組對照組實驗組步驟2mol/L的NaCl溶液5mL不進行任何處理加絲狀物或沉淀物加4mL二苯胺試劑，混勻后，將試管置于沸水中加熱5min結(jié)果溶液不變藍色溶液逐漸變?yōu)樗{色結(jié)論DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會被染成藍色必備技能典例精講模型秒殺巧思妙解必備技能一基因工程的概念[例1](2022秋·四川成都·高二樹德中學?？茧A段練習)下列與基因工程有關(guān)的說法，正確的是(

)A．基因工程育種不能使不同物種的優(yōu)良性狀集中在同一個體中B．常用的基因運載體有大腸桿菌擬核DNA，動植物病毒等C．質(zhì)粒是基因工程中重要的工具酶之一D．基因工程利用基因重組的原理，可定向改變生物的性狀必備技能二限制性內(nèi)切核酸酶[例2](2022春·吉林·高二校聯(lián)考期末)下列關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的敘述，正確的是(

)A．限制性內(nèi)切核酸酶主要從真核生物中提取B．限制性內(nèi)切核酸酶能識別和切割RNAC．限制性內(nèi)切核酸酶能識別任意的核苷酸序列D．限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA后可以形成黏性末端或平末端必備技能三DNA連接酶[例3](2022春·河北石家莊·高二統(tǒng)考期末)下圖表示在適宜條件下，兩個核酸片段經(jīng)過X酶的催化作用形成一個DNA分子片段的過程。下列敘述正確的是(

)A．X酶是DNA聚合酶B．X酶可能是從大腸桿菌中分離得到的C．X酶能催化氫鍵的形成D．X酶能為磷酸二酯鍵的形成提供能量必備技能四常用載體—質(zhì)粒[例4](2022春·河北邢臺·高二統(tǒng)考期末)將外源基因?qū)胧荏w細胞時通常利用質(zhì)粒作為載體，下列關(guān)于質(zhì)粒的說法，錯誤的是(

)A．質(zhì)粒具有自我復制能力，存在于細胞核或擬核之外，化學本質(zhì)是DNAB．質(zhì)粒具有一個或多個限制酶切割位點，供外源DNA片段(基因)插入其中C．真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的D．被用作載體的質(zhì)粒，通常含有特殊的標記基因。如四環(huán)素基因、氨芐青霉素基因等必備技能五DNA粗提取的原理與操作方法[例5](2022秋·浙江寧波·高三鎮(zhèn)海中學校考階段練習)如圖是以雞血為材料進行“DNA粗提取與鑒定”相關(guān)實驗步驟。用高濃度(2mol/L)的NaCl溶液可溶解DNA，低濃度使DNA析出。下列有關(guān)敘述錯誤的是(

)必備技能六限制酶切割后DNA分子片段的分析[例6](2022春·湖北·高二統(tǒng)考期末)用限制酶HindⅢ、BamHⅠ及兩者的混合物分別切割一個長度為4kb(1kb即1千個堿基對)的線性DNA分子，切割產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖甲所示。據(jù)此定位這兩種限制酶的切割位點如圖乙，下列分析錯誤的是()A．瓊脂糖凝膠的加樣孔在甲圖各圖示的上端B．乙圖中b也是BamHⅠ的酶切位點C．乙圖中cd的長度為0．3kbD．若將這個線性DNA分子首尾相連，用HindⅢ切割，只能形成一個4kb的片段必備技能七基因工程操作中限制酶的選擇[例7](2022·福建泉州·統(tǒng)考模擬預測)像BclⅠ(T↓GATCA)、BglⅡ(A↓GATCT)、MboⅠ(↓GATC)這樣，識別序列不同、，但能產(chǎn)生相同的黏性末端的一類限制酶被稱為同尾酶。如圖表示目的基因及質(zhì)粒上的酶切位點。選用不同的限制酶對質(zhì)粒和目的基因進行切割，并用DNA連接酶進行連接。下列分析錯誤的是(

)選項切割質(zhì)粒切割目的基因結(jié)果分析ABclI和BglⅡBclI和BglⅡ形成的重組質(zhì)粒的堿基排列順序不一定相同BBclI和BglⅡMboI切割后的質(zhì)粒不可自我環(huán)化，切割后的目的基因可以自我環(huán)化CMboIBclI和BglⅡ形成的重組質(zhì)?？杀籑boI再次切開，但可能無法被BclI和BglⅡ再次切開DMboIMboI切割后的質(zhì)?？梢宰晕噎h(huán)化，切割后的目的基因也可以自我環(huán)化A．A B．B C．C D．D必刷好題基礎(chǔ)演練能力提升巔峰突破1．(2022秋·四川內(nèi)江·高二威遠中學校?？茧A段練習)下列關(guān)于基因工程的敘述中，不正確的是(

)A．基因工程操作中需要限制酶、DNA連接酶等多種酶參與B．基因工程中常用的運載體有質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒C．基因工程育種的優(yōu)點是可以集中親本的優(yōu)良性狀D．一種限制酶只能識別一種特定核苷酸序列2．(2022春·陜西渭南·高二統(tǒng)考期末)有關(guān)下圖所示的黏性末端的說法，錯誤的是(

)A．甲、乙、丙黏性末端分別是由不同的限制酶切割產(chǎn)生的B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重組DNA分子C．DNA連接酶的作用位點是b處D．切割產(chǎn)生甲的限制酶不能識別由甲、乙黏性末端互補結(jié)合形成的核苷酸序列3．(2022春·云南楚雄·高二統(tǒng)考期末)圖甲、乙分別表示EcoRI和SmaI限制酶識別序列和切割位點(圖中箭頭處)，可形成不同的末端。據(jù)圖分析，下列說法正確的是(

)A．限制酶可作用于DNA的磷酸二酯鍵和氫鍵B．識別黏性末端的DNA連接酶也能識別平末端C．限制酶的識別序列都是由6個核苷酸組成的D．圖甲的末端“縫合”時有氫鍵的重新連接4．(2022春·山東泰安·高二統(tǒng)考期末)某線性DNA分子含有3000個堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的識別序列和切割位點如圖所示。下列有關(guān)說法錯誤的是(

)a酶切割產(chǎn)物(bp)b酶再次切割產(chǎn)物(bp)1600；1100；300800；300A．在該DNA分子中，a酶與b酶的識別序列分別有3個和2個B．a(chǎn)酶與b酶切出的黏性末端可相互連接C．a(chǎn)酶與b酶切斷的化學鍵均為磷酸二酯鍵D．a(chǎn)酶與b酶識別切割的序列不同體現(xiàn)了酶的專一性5．(2022春·吉林·高二校聯(lián)考期末)下列關(guān)于DNA連接酶的說法，正確的是(

)A．都能連接黏性末端和平末端B．作用于DNA的氫鍵C．DNA連接酶和DNA聚合酶作用的部位相同D．都是從原核生物中分離出來的6．(2022春·安徽蕪湖·高二校考期末)基因工程需要多種酶的參與。下列有關(guān)敘述正確的是(

)A．限制酶主要存在于原核細胞中，可識別DNA或RNA上的堿基序列B．DNA連接酶不能識別DNA上堿基序列，但可識別黏性末端或平末端C．解旋酶可破壞磷酸二酯鍵和氫鍵，用于DNA復制過程中解開DNA雙螺旋D．成熟mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化形成的DNA分子能直接轉(zhuǎn)錄翻譯合成蛋白質(zhì)7．(2022·浙江·校聯(lián)考模擬預測)下列關(guān)于DNA的粗提取和鑒定活動中的敘述，正確的是(

)A．用香蕉果肉放入研缽中，倒入95%的酒精進行充分研磨B．在漏斗中墊上濾紙，將研磨液過濾入離心管中C．經(jīng)離心，取上清液倒入冷酒精的小燒杯中D．在含有絮狀物的試管中加入亞甲基藍，進行水浴鍋加熱顯藍色8．(2022春·山東濟寧·高二統(tǒng)考期中)DNA瓊脂糖凝膠電泳是指利用在溶液中帶負電荷的DNA分子在電場中向正極移動的原理，分離、純化或分析PCR擴增后的待檢DNA片段的生物化學技術(shù)。下列說法錯誤的是(

)A．DNA片段相對分子質(zhì)量越大，遷移就越慢B．凝膠制備中加入的核酸染料能與DNA分子結(jié)合，用于分離后DNA片段的檢測C．擬回收的DNA區(qū)帶融化后可先用DNA抽取劑抽提，再用70％的冷乙醇沉淀抽提DNA片段，從而提高回收率D．新冠病毒核酸檢測出現(xiàn)假陽性的原因可能是陽性對照中模板核酸與樣品交叉污染9．(2022秋·河北邯鄲·高三邯鄲一中?？茧A段練習)甜柿鮮果肉中含有可溶性糖、微量元素、維生素和β一胡蘿卜素等多種成分，營養(yǎng)價值高，深受消費者的喜愛。甜柿的自然脫澀與乙醛代謝關(guān)鍵酶基因(PDC)密切相關(guān)，推測澀味程度可能與PDC基因的表達情況有關(guān)。為篩選PDC基因的調(diào)控蛋白，科研人員進行了下列實驗?；卮鹣铝袉栴}。(1)啟動子位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點，同時啟動子區(qū)域存在著許多調(diào)控蛋白的結(jié)合位點，RNA聚合酶和調(diào)控蛋白共同影響了基因的______水平。(2)PDC基因的啟動子序列未知，為獲得大量該基因啟動子所在片段，可利用限制酶將基因組DNA進行酶切，然后在___________的作用下將已知序列信息的接頭片段連接在PDC基因的上游，根據(jù)接頭片段和PDC基因編碼序列設(shè)計引物進行__________擴增，在擴增過程中使用的酶稱為____，在該酶的作用下可以將4種脫氧核苷酸加到引物____的一端。(3)AD基因表達出的AD蛋白與啟動子足夠靠近時，能夠激活后續(xù)基因轉(zhuǎn)錄，據(jù)此可利用與AD蛋白形成的融合蛋白來篩選待測蛋白。利用質(zhì)粒A構(gòu)建含有PDC基因啟動子片段的重組質(zhì)粒并導入代謝缺陷型酵母菌，用不含__________的培養(yǎng)基可篩選出成功轉(zhuǎn)化的酵母菌Y1H；將從甜柿中提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄形成的各種cDNA與質(zhì)粒G連接后導入酵母菌，此時應(yīng)選擇質(zhì)粒G中的位點__________(填序號1～5)作為cDNA的插入位點，最終獲得攜帶不同cDNA片段的酵母菌群Y187。(4)重組酵母Y1H與Y187能夠進行接合生殖，形成的接合子含有兩種酵母菌質(zhì)粒上的所有基因。若接合子能在含有__________的培養(yǎng)基中生存，則推測待測蛋白是PDC基因的調(diào)控蛋白。10．(2022春·江蘇連云港·高二統(tǒng)考期中)科研人員通過觀察老年(65歲～79歲)14例、高齡(80歲～89歲)16例及長壽老人(≥90歲)12例，肝、脾組織基因組DNA含量的變化及差異，探討衰老進程中DNA含量變化的規(guī)律，并為今后的衰老相關(guān)研究提供實驗數(shù)據(jù)。實驗的主要操作步驟如下：一、稱取組織100mg放入80℃冰箱；二、將組織放入1.5ml離心管，同時加入樣品裂解液，并用微量電動勻漿器充分勻漿；三、加入蛋白酶，56℃消化48h，90℃高溫蛋白質(zhì)變性1h；四、加入______酶和緩沖液，37℃水浴鍋中放置1h，以去除樣品中的RNA；五、加入等體積的冷乙醇，離心取_